Dynamisch geregelte zwei

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4977 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Viele RNA-Viren nutzen interne Ribosomeneintrittsstellen (IRESs) in ihrer genomischen RNA, um die Translationsmaschinerie des Wirts für die Replikation zu steuern. Das IRES des Enzephalomyokarditis-Virus (EMCV) interagiert mit dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4 G (eIF4G) und rekrutiert die ribosomale Untereinheit für die Translation. Hier analysieren wir die dreidimensionale Struktur des Komplexes aus EMCV IRES, dem HEAT1-Domänenfragment von eIF4G und eIF4A mittels Kryo-Elektronenmikroskopie. Es werden zwei unterschiedliche eIF4G-interagierende Domänen auf dem IRES identifiziert, und die Komplexbildung verändert den Winkel zwischen ihnen. Darüber hinaus untersuchen wir die Dynamik dieser Domänen mithilfe der Lösungs-NMR-Spektroskopie und zeigen Konformationsgleichgewichte im Mikro- bis Millisekundenbereich auf. In den niedrig besetzten Konformationen wird das Basenpaarungsregister einer Domäne mit dem Strukturübergang der Drei-Wege-Verbindung verschoben, wie in der komplexen Struktur. Unsere Studie liefert Einblicke in die ausgeklügelte Strategie der viralen RNA für ein optimales Andocken, um das Wirtsprotein zu kapern.

RNA-Viren untergraben die Translationsmaschinerie des Wirts, um zelluläre Ribosomen anzugreifen, was für die Förderung der viralen Genomtranslation für die Replikation unerlässlich ist1,2,3,4. Ein solcher Mechanismus nutzt interne Ribosomeneintrittsstellen (IRESs) in den 5′-untranslatierten Regionen des RNA-Genoms, die die Translationsmaschinerie des Wirts durch mehrere RNA-RNA- und/oder RNA-Protein-Wechselwirkungen steuern. Die Regulierung der IRES-abhängigen Translation ist daher ein entscheidender Schritt für die Infektion und Replikation dieser Viren mit vielfältigen Auswirkungen auf Virulenz, Gewebetropismus und Pathogenität2. Darüber hinaus könnten einige eukaryotische zelluläre mRNAs auch den IRES-abhängigen Translationsmechanismus nutzen, um Prozesse wie Entwicklung und Reaktionen auf zellulären Stress zu regulieren3,4.

IRESs sind cis-wirkende RNA-Elemente, die typischerweise dreidimensionale Strukturen annehmen, entweder um direkt mit der ribosomalen 40S-Untereinheit zu interagieren oder um Translationsfaktoren für die Rekrutierung der 40S-Untereinheit zu aktivieren. Unter den bisher identifizierten IRESs weist das Enzephalomyokarditis-Virus (EMCV) in der Familie Picornaviridae eine der höchsten Translationseffizienzen auf und erfordert die eukaryotischen Initiationsfaktoren (eIFs) 4G, 4A, 2 und 3, um die 40S-Untereinheit für die Translation zu rekrutieren Einweihung5. Diese Anforderung der EMCV-IRES ähnelt denen einiger eukaryotischer zellulärer IRESs6,7, was auf mechanistische Ähnlichkeiten mit den eukaryotischen Gegenstücken schließen lässt. Das EMCV IRES-Element interagiert direkt mit der HEAT1-Domäne von eIF4G (eIF4GHEAT1), und diese Interaktion wird noch verstärkt, wenn eIF4GHEAT1 im Komplex mit eIF4A8,9 steht (Abb. 1a, b). Innerhalb des EMCV IRES ist die Region G680-C787, in dieser Studie als JK-St bezeichnet, für die spezifische Erfassung des eIF4GHEAT1 verantwortlich. Wir haben die Struktur dieser JK-St-Region zuvor durch Lösungs-NMR-Spektroskopie9 bestimmt. Es besteht aus zwei Stammschleifen (J- und K-Domänen), die sich von einem Basisstamm (St-Domäne) aus verzweigen (Abb. 1c). An der Drei-Wege-Verbindung bildet eine hochkonservierte Sequenz von sechs Adenosinen eine kurze Stammschleife, ASL genannt, die mit den J-, K- und St-Domänen am Verbindungsteil interagiert. Mithilfe biochemischer Tests wurden mehrere Interaktionsstellen am JK-St oder eIF4GHEAT1 gemeldet10,11,12. Obwohl eIF4GHEAT1 angeblich an zelluläre RNAs bindet13,14, ist die Wechselwirkung zwischen JK-St und eIF4GHEAT1 stärker und sequenz- und/oder strukturspezifischer15, was darauf hindeutet, dass sich JK-St so entwickelt hat, dass es eIF4GHEAT1 spezifisch fängt. Der strukturelle Mechanismus, durch den die JK-St-Region eIF4GHEAT1 spezifisch erkennt, ist jedoch weitgehend unbekannt. Typische RNA-bindende Proteine ​​verwenden Schnittstellen, an denen positiv geladene Reste wie Arginin oder Lysin und/oder aromatische Reste wie Tyrosin oder Phenylalanin für die spezifische Erkennung der Ziel-RNA-Moleküle geclustert und ausgerichtet werden16,17,18. Allerdings fehlen eIF4GHEAT1 Cluster solcher Reste12 (ergänzende Abbildung 1), was durch die Vorhersage von RNA-Bindungsresten in eIF4GHEAT1 aus der Struktur und/oder Sequenzanalysen bestätigt wird, die keine RNA-Bindungsschnittstelle identifizieren19,20. Darüber hinaus sollte die virale IRES-RNA an eIF4GHEAT1 binden, ohne ihre angeborene Funktion bei der Translation zu stören, um das Translationssystem des Wirts zu kapern und auszunutzen. nämlich die Rekrutierung von eIF4A. Um diese Bedingung zu erfüllen, sollte JK-St an eIF4GHEAT1 binden, ohne mit eIF4A zu konkurrieren, was die möglichen Bindungsstellen auf eIF4GHEAT1 weiter einschränkt.

a Schematische Darstellung des von EMCV IRES gebildeten Translationsinitiationskomplexes. Die JK-St-Region interagiert direkt mit dem Gerüstprotein eIF4G der Wirtszelle, was zur Rekrutierung von eIF4A, eIF3, eIF2 und der ribosomalen 40S-Untereinheit zum Initiationscodon führt. Diese Zahl ist aus Lit. übernommen. 9. b Domänenorganisation des eIF4G- und eIF4GHEAT1-Konstrukts in voller Länge. c NMR-Struktur von JK-St im freien Zustand9 (PDB-ID: 2NBX). d Gesamtstruktur des ternären Komplexes JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A, überlagert mit der tiefpassgefilterten Kryo-EM-Dichtekarte. e Fokussierte Kryo-EM-Karte (links) und die Struktur (rechts) von JK-St/eIF4GHEAT1. Die J-, K- und St-Domänen von JK-St sind zusammen mit der ASL-Domäne an der Verbindungsstelle markiert. Mg2+-Ionen werden als schwarze Kugeln dargestellt. f, g Elektrostatische Potentialdarstellungen der Oberfläche von eIF4GHEAT1 an der Schnittstelle zwischen der J-Domäne (f) und der St-Domäne (g), konturiert von –5 kT/e (rot) bis +5 kT/e (blau). Die mit dem eIF4GHEAT1 in Kontakt stehenden Rückstände des JK-St sind als Stäbchen dargestellt. Die Markierungen der extrudierten Reste, A724 auf der J-Domäne (f) und G777 auf der St-Domäne (g), sind durch Kästchen hervorgehoben. h Vergleich der Domänenorientierungen. Die Strukturen von JK-St im freien Zustand und im Komplex mit eIF4GHEAT1/eIF4A werden als Oberflächen- bzw. Ribbon-and-Stick-Darstellung dargestellt. Die J-, K-, St- und ASL-Domänen sind jeweils grün, blau, orange und rot gefärbt. Die Strukturen sind an der K-Domäne ausgerichtet und Änderungen in der Ausrichtung der J- und St-Domänen bei komplexen Bildungen sind als schwarze Pfeile dargestellt.

Hier analysieren wir die dreidimensionale Struktur des ternären Komplexes JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A mithilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM). Die Struktur weist zwei unterschiedliche Bindungsstellen in der JK-St-Region auf. Jeder interagiert mit zwei getrennten negativ geladenen Spalten bzw. den umgebenden positiv geladenen Flecken auf eIF4GHEAT1 über die extrudierten Nukleobasen A724 aus der J-Domäne und G777 aus der St-Domäne. Wichtig ist, dass diese Nukleobasen in der im freien Zustand analysierten Struktur nicht ausgeklappt, sondern innerhalb der Stämme gestapelt sind, während in der ternären Komplexstruktur beide ausgeklappt sind. Darüber hinaus unterscheidet sich die relative Ausrichtung der J- und St-Domänen deutlich von der im freien Zustand. Wir führen Lösungs-NMR-Analysen durch, um die dynamischen Eigenschaften dieser eIF4GHEAT1-Bindungsstellen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die J- und St-Domänen unterschiedliche dynamische Modi nutzen: Die Ausbuchtungen in der J-Domäne befinden sich in Konformationsgleichgewichten, in denen A724 in der Ausbuchtung nicht stark gestört wird, während sich die St-Domäne in Konformationsgleichgewichten der Registerverschiebung im Einklang mit dem befindet ASL-Domäne, was zur Freigabe von G777 aus der Stacking-Interaktion führt. Im Konformationsgleichgewicht nimmt ASL eine Konformation an, die die beiden Bindungsstellen in die für die Bindung optimalen Positionen bringt. Diese Dynamik ist wichtig für die Erfassung von eIF4GHEAT1, da die Unterdrückung dieser Dynamik durch Mutationen die Wechselwirkungen aufhob, ohne die eIF4GHEAT1-bindenden Reste zu beeinträchtigen. Insgesamt unterstreicht unsere Studie die Erkenntnis, dass sich das EMCV-IRES so entwickelt hat, dass es die beiden eIF4GHEAT1-Bindungsdomänen nutzt, die jeweils auf die beiden kleinen Patches auf dem Zielprotein zugeschnitten sind. Diese beiden Domänen können aufgrund fehlender ausreichender intermolekularer Wechselwirkungen nicht selbstständig an das Zielprotein binden, können jedoch einen stabilen Komplex bilden, wenn sie durch die dynamische Neuanordnung der ASL an der Drei-Wege-Verbindung konsolidiert und an den optimalen Positionen lokalisiert werden . Diese mechanistischen und funktionellen Erkenntnisse verdeutlichen die elegante Strategie der viralen RNA, das Wirtsprotein für eine effiziente Replikation einzufangen.

In dieser Studie verwendeten wir JK-St (G680-C787 in der EMCV-Genom-RNA), die HEAT1-Domäne von menschlichem eIF4G (Reste 746–992), bezeichnet als eIF4GHEAT1, und das menschliche eIF4A voller Länge. Das Experiment zur isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) ergab, dass JK-St in Gegenwart von 2 mM Mg2+ bzw. in Abwesenheit von Mg2+ mit Kd-Werten von 0,149 ± 0,012 und 2,07 ± 0,28 μM an eIF4GHEAT1 bindet (ergänzende Abbildung 2a, b). ), was die Mg2+-Abhängigkeit der Wechselwirkung zeigt. Wir analysierten die Struktur des JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A-Komplexes in Gegenwart von Mg2+ mit einer Auflösung von 3,8 Å mittels Kryo-EM (Abb. 1d und ergänzende Abb. 2c, 3, 4, 5). In der Struktur kontaktieren die J- und St-Domänen direkt eIF4GHEAT1, während eIF4A nicht mit der JK-St-Region interagiert (Abb. 1d). Während die Kryo-EM-Karte in der Region JK-St/eIF4GHEAT1 gut aufgelöst war, wies die Region eIF4A eine schwächere EM-Dichte auf, insbesondere am N-terminalen Lappen, was die Flexibilität der Untereinheit widerspiegelt (ergänzende Abbildung 4a). Eine weitere lokale Verfeinerung mit einer Maske auf JK-St/eIF4GHEAT1 ergab die fokussierte Kryo-EM-Karte der Region mit einer Auflösung von 3,7 Å (Abb. 1e und ergänzende Abb. 3). In der J-Domäne interagieren G702, U703, A704, C705, U722, G723, A724 und U725 mit eIF4GHEAT1 von der Seite der kleinen Furche aus (Abb. 1f und ergänzende Abb. 5b). Alle diese Basen außer A724 interagieren hauptsächlich mit dem positiv geladenen Bereich auf eIF4GHEAT1, einschließlich der Seitenkettenatome von Arg 840, Lys841, Lys922, Lys925 und Arg954, während die Nukleobase von A724 aus dem Stamm extrudiert wird, um tief mit dem zu interagieren negativ geladener Spalt einschließlich Seitenkettenatomen von Asp918. In der St-Domäne interagieren G690, A691, U692, G693, C776, G777, U778 und C779 auch mit eIF4GHEAT1 von der Seite der kleinen Furche aus (Abb. 1g und ergänzende Abb. 5c). Alle diese Reste, mit Ausnahme von G777, interagieren hauptsächlich mit dem positiv geladenen Bereich auf eIF4GHEAT1, einschließlich der Seitenkettenatome von Lys826 und Asn838, während die Nukleobase von G777 aus dem Stamm extrudiert wird, um mit einem anderen negativ geladenen Bereich, einschließlich der Carboxyatome der Hauptkette, zu interagieren Thr784, Leu786 und Ala824, die sich von denen unterscheiden, die von der J-Domäne kontaktiert werden. Basierend auf der Kryo-EM und früheren NMR-Strukturanalysen ist der Winkel zwischen den J- und St-Stammdomänen im JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A-Komplex im Vergleich zu dem im freien Zustand gebildeten Winkel deutlich verändert (Abb. 1h). wohingegen die Strukturen von eIF4GHEAT1 / eIF4A selbst immer noch den Freistaatsstrukturen ähnelten (ergänzende Abbildung 5a).

Vergleiche der Strukturen von JK-St im Komplex mit eIF4GHEAT1 und eIF4A, analysiert durch Kryo-EM (Abb. 2a), mit denen im freien Zustand, analysiert durch NMR9 (Abb. 2b), zeigten mehrere Veränderungen in den Sekundärstrukturen (Abb. 2). , graue Hintergründe). In der J-Domäne in der Free-State-Struktur bilden die eIF4GHEAT1-Bindungsbasen Ausbuchtungen und sind innerhalb der Ausbuchtung gestapelt; Das heißt, A700 ist nicht basengepaart, A704 ist basengepaart mit U720, C705 mit A719 und A724 ist nicht basenpaarig, sondern innerhalb der Ausbuchtung gestapelt. In der Struktur des Kryo-EM-Komplexes im eIF4GHEAT1-gebundenen Zustand bilden diese Basen immer noch Ausbuchtungen mit geringfügigen Änderungen in den nicht-kanonischen Basenpaarungsmustern; Das heißt, A700 ist mit G723 basengepaart, U703 mit U720 und A724 ist ausgeklappt. Diese Basenpaarveränderungen treten ausschließlich in den Ausbuchtungen auf, die direkt an eIF4GHEAT1 binden.

a Die Sekundärstruktur von JK-St im Komplex mit eIF4GHEAT1 und eIF4A, bestimmt durch Kryo-EM in dieser Studie. Nicht modellierte Basen werden hellgrau dargestellt. b Die Sekundärstruktur des JK-St im freien Zustand, bestimmt durch NMR9. Die Linien zwischen den Basen geben die kanonischen Watson-Crick-Basenpaare an, die Punkte die Wobble-Basenpaare und die gestrichelten Linien die nichtkanonischen Basenpaare. Die eIF4GHEAT1-bindenden Reste sind durch violette Linien hervorgehoben. Die J-, K-, St- und ASL-Domänen sind jeweils grün, blau, orange und rot gefärbt. Die Unterschiede zwischen diesen beiden Strukturen werden durch graue Hintergründe hervorgehoben.

Im krassen Gegensatz dazu treten strukturelle Umlagerungen nicht nur an den eIF4G-interaktivierenden Stellen in der St-Domäne auf, sondern auch an solchen, die nicht direkt an der Interaktion mit eIF4GHEAT1 beteiligt sind (Abb. 2). In unserer vorherigen Freizustandsstruktur bildet die ASL-Domäne eine kurze Stammschleife, und der obere Stamm der St-Domäne bildet fünf aufeinanderfolgende Watson-Crick- oder Wobble-Basenpaare, gestapelt mit einem nichtkanonischen Ade-Ade-Basenpaar; dh A688-A781, G689-U780, G690-C779, A691-U778, U692-G777 und G693-C776. In der JK-St-Struktur im Komplex mit eIF4GHEAT1/eIF4A bildet die ASL-Domäne nicht die kurze Stammschleife, und der obere Stamm der St-Domäne, der die eIF4GHEAT1-Bindungsstelle enthält, weist große Basenpaarungsumlagerungen innerhalb auf ASL-Domänenbasen; dh G686-A781, A687-U780, G689-C779, G690-U778, A691-C776, U692-A774 und G683-A773. G777 wird ausgeklappt, um mit der Spalte von eIF4GHEAT1 zu interagieren. Zusammengenommen zeigt der Vergleich, dass die Interaktion der JK-St-Region mit eIF4GHEAT1 mehrere strukturelle Umlagerungen beinhaltet: Die J-Domäne wird innerhalb der Ausbuchtung lokal gestört, wohingegen der obere Stamm der St-Domäne mit der Änderung der ASL-Domäne weitgehend neu angeordnet wird. obwohl beide mit dem Herausklappen der wichtigsten Extrusionsreste A724 und G777 einhergehen. Wichtig ist, dass beide Domänen für die Bindung an eIF4GHEAT1 erforderlich sind, da keine der isolierten Domänen an eIF4GHEAT1 binden kann (ergänzende Abbildung 2d, e)9.

Um Einblicke in den Mechanismus zu gewinnen, der dem Einfangen des Wirtszielproteins durch die virale RNA zugrunde liegt, verwendeten wir Lösungs-NMR, um die dynamischen Eigenschaften der eIF4GHEAT1-Bindungsstellen von JK-St zu charakterisieren. Zu diesem Zweck verwendeten wir die Isotopenmarkierung [u-2H, Ade-{1H2, 1H8, 13C8}, Gua-{1H8, 13C8}] von RNA-Proben und verwendeten sie in Kombination mit für die aromatische Querrelaxation optimierter 1H−13C-Spektroskopie ( TROSY)21 (ergänzende Abbildung 6), die die Beobachtung von NMR-Signalen ermöglicht, die die Struktur und Dynamik von RNA mit hoher Empfindlichkeit widerspiegeln. Die aromatischen 1H8-13C8-TROSY-Signale der isolierten J-Domäne überlappten mit denen des JK-St voller Länge, was bestätigt, dass die Struktur der isolierten J-Domäne wie im JK-St9 voller Länge erhalten bleibt (ergänzende Abbildung 7a, B). Die aus dem 13C-Einzelquanten-Relaxationsdispersionsexperiment (SQ) erhaltenen Rex-Werte, bei denen es sich um den Beitrag des chemischen Austauschs zur transversalen Relaxationsrate R2 handelt, spiegeln den Grad der Strukturdynamik in der μs-ms-Zeitskala wider, der für die Funktion vieler RNAs entscheidend ist22 . Die Rex-Analysen der isolierten J-Domäne wurden dann basenspezifisch in Abwesenheit von eIF4GHEAT1 bei 30 ° C durchgeführt (Abb. 3a). Infolgedessen zeigten G701, A704, G718 und G723 Rex-Werte von mehr als 10 s−1, wohingegen G702 und A719 nicht quantitativ analysiert werden konnten, da ihr größerer Dynamikgrad die Quantifizierung der Signalintensitäten erschwerte, was darauf hindeutet, dass dies bei den Basen der Fall ist in Konformationsaustauschprozessen in einer μs-ms-Zeitskala. Diese Basen befinden sich innerhalb oder neben den Ausbuchtungen der J-Domäne, die mit eIF4GHEAT1 interagieren (Abb. 3a). Wichtig ist, dass A724, dessen Nukleobase in der komplexen Struktur in die Spalte von eIF4GHEAT1 extrudiert wird, einen relativ kleinen Rex-Wert von 3,7 ± 0,2 s−1 aufwies. Da diese Base in der Freizustandsstruktur in der Ausbuchtung mit den benachbarten Basen G723 und U725 gestapelt ist (Abb. 2b), deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass A724 im Wesentlichen während der gesamten Verlaufsdauer der chemischen Austauschprozesse gestapelt bleibt. Zusammengenommen zeigten die Rex-Analysen der isolierten J-Domäne, dass das Ausklappen der A724-Nukleobase nicht von selbst erfolgt und daher erst nach dem Andocken der J-Domäne an eIF4GHEAT1 eingeleitet werden kann.

a Links: Restspezifische Rex-Werte der J-Domäne. Die Reste, die aufgrund umfangreicher Konformationsaustausche im μs-ms-Zeitraum nicht quantitativ analysiert werden konnten, werden als grauer Hintergrund angezeigt. Mitte und rechts: Zuordnung der Rex-Werte in der Sekundärstruktur (Mitte) und Tertiärstruktur der zuvor gemeldeten J-Domäne (rechts, PDB-ID: 2NBY)9. Die Ade/Gua-Reste, die Rex-Werte größer als 10 s−1 aufwiesen, sind rot gefärbt, während diejenigen zwischen 5 und 10 s−1 cyan sind. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. b Links: Restspezifische Rex-Werte der StASL-Domäne. Rückstände, die aufgrund umfangreicher Konformationsaustausche im μs-ms-Zeitraum nicht quantitativ analysiert werden konnten, werden mit grauem Hintergrund angezeigt. Mitte und rechts: Zuordnung der Rex-Werte im Sekundärstruktur- (Mitte) und Tertiärstrukturmodell (rechts), das aus der zuvor berichteten Struktur der ΔJΔK-Domäne9 (PDB-ID: 2NC1) durch Ersetzen der GAAA-Tetraloops durch das UUCG abgeleitet wird Tetraloops. Die Ade/Gua-Reste, die Rex-Werte größer als 10 s−1 aufwiesen, sind rot gefärbt, während diejenigen zwischen 5 und 10 s−1 cyan sind. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Fehlerbalken zeigen experimentelle Fehler an, die aus dem Signal-Rausch-Verhältnis jeder Korrelation abgeleitet werden, wie in Methoden beschrieben.

Um die Konformationsdynamik der eIF4GHEAT1-Interaktionsstelle auf der St-Domäne zu analysieren, verwendeten wir ein als StASL-Domäne bezeichnetes Konstrukt (Abb. 3b), das die isolierten St- und ASL-Domänen umfasst, da die St-Domäne bei der Bindung strukturell neu angeordnet wird zu eIF4GHEAT1 beinhaltet Änderungen in der ASL-Domäne (Abb. 2). Die aromatischen 1H8-13C8-TROSY-Signale der isolierten StASL-Domänenprobe überlappten mit denen des JK-St voller Länge, was bestätigt, dass die Struktur der isolierten StASL-Domäne wie im JK-St9 voller Länge erhalten bleibt (ergänzende Abbildung 7a). , C). Die Rex-Werte der StASL-Domäne wurden bei 30 °C ermittelt und aufgezeichnet (Abb. 3b). Die Nukleobasen von A688, G690, A691, G693, A775 und G777 zeigten Rex-Werte größer als 10 s−1, wohingegen die Nukleobasen von A687, A771, A772, A773 und A774 moderate Rex-Werte zwischen 5 und 10 s−1 aufwiesen , was darauf hinweist, dass sich die Basen in einem μs-ms-Zeitraum in Konformationsaustauschprozessen befinden. G731 konnte nicht quantitativ analysiert werden, da die große Dynamik die Quantifizierung der Signalintensitäten erschwerte. Interessanterweise zeigte G777, dessen Nukleobase in der komplexen Struktur in die Spalte von eIF4GHEAT1 extrudiert wird, den größten Rex-Wert von 21,2 ± 2,0 s−1, was darauf hindeutet, dass die Base chemische Austauschprozesse im μs-ms-Zeitraum durchläuft.

Um die für die StASL-Domäne beobachtete Dynamik weiter zu charakterisieren, untersuchten wir die Temperaturabhängigkeit der aromatischen 1H8-13C8-TROSY-Signale, die die Änderung des Konformationsgleichgewichts bei Temperaturänderungen widerspiegeln. Alle Basen, die Rex-Werte von mehr als 5 s−1 aufwiesen (Abb. 3b), mit Ausnahme von G777, zeigten lineare chemische Verschiebungsänderungen bei Temperatursenkung von 35 °C auf 10 °C, wohingegen G777 nichtlineare chemische Verschiebungsänderungen aufwies (Abb. 4a). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die meisten Basen (mit Ausnahme von G777) in einem Gleichgewicht zwischen mindestens zwei Zuständen existieren, während G777 dies in mindestens drei Zuständen der Fall ist, wobei die Populationen jedes Zustands durch Temperaturänderungen gestört werden. Anschließend analysierten wir die 13C-SQ-Relaxationsdispersionsprofile der StASL-Domäne, die die Abhängigkeit der NMR-Pulsfrequenz (νCPMG) des effektiven R2 einschließlich des chemischen Austauschbeitrags R2,eff darstellen. Diese Profile liefern Einblicke in Austauschprozesse im Hinblick auf den Wechselkurs kex, die relativen Populationen der Austauschzustände p und den Unterschied in der chemischen Verschiebung Δω23. Das schnelle Zwei-Zustands-Austauschmodell24 mit einem einzigen Wechselkurs (18.500 ± 360 s-1) erklärte gleichzeitig die 13C-SQ-Relaxationsdispersionsprofile von A687, A688, G690, A691, G693, A771, A772, A773, A774 und A775. Dies zeigt, dass der chemische Austausch dieser Reste kooperativ erfolgt (Abb. 4b, oben und ergänzende Abb. 8). Da sich G777 im oberen Stamm der St-Domäne befindet, wo sich alle A688, G690, A691 und G693 befinden, sollte auch G777 diesem chemischen Austauschprozess unterliegen. Unter Verwendung der Austauschparameter, die aus den oben erwähnten globalen Anpassungsanalysen erhalten wurden, wurden die 13C-SQ-Relaxationsdispersionsprofile von G777 numerisch an das Drei-Zustands-Austauschmodell angepasst, bei dem G777 zwischen dem Grundzustand (GS) und zwei unterschiedlichen angeregten Zuständen übergeht 1 und 2 (ES1 und ES2), die nicht als chemische Verschiebungsunterschiede der anderen Basen unterschieden werden (Abb. 4b, unten). Als Ergebnis erhielten wir einen Satz kinetischer Parameter und die chemischen 13C-Verschiebungen von G777 C8 in jedem Zustand (Abb. 4c, ergänzende Abb. 9, 10). Die Populationen von GS, ES1 und ES2 betragen 80,4 ± 2,9, 17,9 ± 2,9 bzw. 1,7 ± 0,1 %, während die chemischen Verschiebungswerte des C8-Atoms von G777 in diesen Zuständen 138,2, 136,6 bzw. 138,5 ppm betragen , mit Wechselkursen von 18.600 ± 120, 410 ± 370 und 230 ± 70 s−1 zwischen GS und ES1, ES1 und ES2 bzw. GS und ES2. Hierbei ist zu beachten, dass die chemischen Verschiebungen von A687, A688, G690, A691, G693, A771, A772, A773, A774 und A775, die mit dem schnellen Zwei-Zustands-Austauschmodell analysiert wurden, zwischen ES1 und ES2 nicht zu unterscheiden sein sollten für jede Basis, wodurch offenbar das Drei-Zustands-Austauschmodell (Abb. 4c) auf das schnelle Zwei-Zustands-Austauschmodell reduziert wird. Somit befinden sich der obere St-Stamm und die ASL-Domäne im chemischen Dreizustandsaustausch zwischen GS, ES1 und ES2, bei dem die chemischen Verschiebungen von G777 zwischen ES1 und ES2 gestört sind.

a Temperaturabhängigkeiten der 1H8-13C8 aromatischen TROSY-Signale von A771 (ASL-Domäne) und G777 (St-Domäne). Spektren, die bei 10, 15, 20, 25, 30 und 35 °C bei der 1H-Frequenz von 1,0 GHz aufgenommen wurden, werden in Braun, Violett, Orange, Rot, Grün bzw. Blau angezeigt. b Anpassung der Relaxationsdispersionskurve. R2,eff-Werte, die bei 30 °C und bei den 13C-Frequenzen 250 MHz und 150 MHz (1H-Frequenzen 1,0 GHz und 600 MHz) erhalten wurden, werden durch rote bzw. blaue Punkte dargestellt. Das Relaxationsdispersionsprofil von G777 wurde mit dem 3-Site-Austauschmodell angepasst, in dem es zwei verschiedene chemische Verschiebungen in den angeregten Zuständen aufweist, wobei kinetische Parameter verwendet wurden, die aus der globalen Anpassung mit dem 2-Site-Austauschmodell erhalten wurden (siehe auch ergänzende Abbildung). 8). Die angepassten Kurven werden als rote und blaue Linien für die 13C-Frequenzen 250 MHz bzw. 150 MHz dargestellt. Fehlerbalken zeigen experimentelle Fehler an, die aus dem Signal-Rausch-Verhältnis jeder Korrelation abgeleitet werden, wie in Methoden beschrieben. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c Oben: Die aus dem Relaxationsdispersionsprofil bei 30 °C erhaltenen Austauschparameter. Unten: Die chemischen Verschiebungen von 13C8 von G777. Unter den beobachteten chemischen Verschiebungen ist 137,9 ppm der kinetische Durchschnitt des Grundzustands (138,2 ppm), des angeregten Zustands 1 (136,6 ppm) und des angeregten Zustands 2 (138,5 ppm). Vorhergesagte chemische Verschiebungswerte von 13C8 von G777 aus der idealen A-Form-Helixstruktur (137,0 ppm), der NMR-Struktur von JK-St im freien Zustand (138,1 ppm) und der Kryo-EM-Struktur von JK-St im Komplex mit eIF4GHEAT1 (140,6 ppm) sind grau dargestellt, was darauf hinweist, dass die chemischen Verschiebungen von 13C8 hauptsächlich die Stapelung mit dem vorhergehenden Rest widerspiegeln. Beachten Sie, dass die vorhergesagten chemischen Verschiebungswerte um die TROSY-Signale durch Hinzufügen von 0,5 ppm korrigiert werden.

Berichten zufolge korrelieren die chemischen 13C8-Verschiebungen von Purinbasen (Adenosin und Guanosin) mit dem Grad der Stapelung mit der vorhergehenden Base auf der 5′-Seite25,26,27; in diesem Fall C776. Tatsächlich schätzte eine abstandsbasierte Berechnung28 die chemische Verschiebung von 13C8 eines Guanosins in der idealen A-Form-Helixstruktur, in der das vorangehende Cytosin vollständig auf das Guanosin gestapelt ist, auf 137,0 ppm, die von G777 in der NMR-Struktur im im freien Zustand, in dem C776 nur teilweise gestapelt ist, mit 138,1 ppm und der von G777 aus der Kryo-EM-Struktur im Komplex, in dem G777 ohne intramolekulare Stapelwechselwirkungen herausgedreht ist, mit 140,6 ppm (Abb. 4c). Da die 13C8-chemischen Verschiebungen von G777 in GS, ES1 und ES2 138,2, 136,6 bzw. 138,5 ppm betragen, veranschaulichen diese Werte, dass G777 in ES1 stärker und in ES2 weniger gestapelt ist als in GS (Abb. 4c). Im Folgenden bezeichnen wir diese Konformationen in ES1, ES2 und GS als angeregte Konformation (EC) 1, EC2 bzw. Grundkonformation (GC). Die GC, die bei 30 °C die am häufigsten vorkommende Konformation (80,4 %) darstellt, entspricht der NMR-Struktur9, in der G777 teilweise gestapelt ist, was durch die Übereinstimmung der chemischen Verschiebung mit G777 in der GC und den aus der NMR-Struktur berechneten Wert bestätigt wird. Die schwach besiedelten angeregten Konformationen wurden in früheren NMR-Strukturanalysen, die sich auf die am stärksten besiedelte Grundkonformation konzentrierten, nicht nachgewiesen. In dieser Studie wurden diese angeregten Konformationen beobachtet, indem NMR-Relaxationsdispersionsanalysen durchgeführt wurden, um die dynamischen Eigenschaften von JK-St zu untersuchen.

Um den Mechanismus zu klären, der den Änderungen in den Stapelwechselwirkungen bei G777 zugrunde liegt, versuchten wir, das für die StASL-Domäne beobachtete Konformationsgleichgewicht weiter zu charakterisieren, indem wir die angeregten Konformationen stabilisierten. Zunächst wurde die U778C-Variante entworfen. U778 ist in der NMR-Struktur im freien Zustand mit A691 basengepaart, während es im Komplex mit eIF4GHEAT1 mit G690 das GU-Wobble-Basenpaar bildet (Abb. 2). Im 1H-1H-NOESY-Spektrum bei 10 °C, wo Kreuzpeaks beobachtet werden, wenn zwei Iminoprotonen (1Himino) in räumlicher Nähe (<5 Å) sind, wurden Kreuzpeaks nur zwischen den Iminoprotonen von U780, G689 und G690 beobachtet für die U778C-Variante (Abb. 5a). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Basenpaare A687-U780, G689-C779 und G690-C778 durch eine einzelne U-zu-C-Substitution an Position 778 stabilisiert werden, möglicherweise aufgrund des destabilisierenden Watson-Crick (WC)-Basenpaars A691-U778 Stabilisierung des Wobble-Basenpaars G690-U778 gegenüber dem GC-WC-Basenpaar (Abb. 5b, ergänzende Abb. 11). Diese Registerverschiebung ändert das Basenpaarungsmuster des oberen St-Stamms in das im eIF4GHEAT1-gebundenen Zustand beobachtete Muster (Abb. 2, 5b). Anschließend verglichen wir die 1H8-13C8-aromatischen TROSY-Signale von G690, das im Register-verschobenen oberen St-Stamm mit C778 basengepaart ist. Für die Wildtyp-StASL-Domäne verschoben sich die chemischen Verschiebungswerte von G690 linear, wenn die Temperatur von 35 ° C auf 10 ° C gesenkt wurde, was auf die Populationsverschiebung des Konformationsgleichgewichts hinweist (Abb. 5c). Für die U778C-Variante der StASL-Domäne wurde das Signal bei 35 °C auf der Linie beobachtet, die aus den temperaturabhängigen chemischen Verschiebungsänderungen, die für den Wildtyp beobachtet wurden, in Richtung der niedrigeren Temperatur extrapoliert wurde, und verschob sich mit steigender Temperatur weiter auf der Linie sank auf 10 °C, wo das 1Himino-1Himino-NOESY-Spektrum (Abb. 5a) aufgenommen wurde. Dies weist darauf hin, dass die angeregten Konformationen (EC1 und EC2) im Konformationsgleichgewicht, das für den oberen St-Stamm beobachtet wurde, mit der registerverschobenen Konformation übereinstimmen, die für die U778-Variante beobachtet wurde, und dass die Population angeregter Konformationen durch Absenken der Temperatur zunimmt. Da G777 in dieser registerverschobenen Konfiguration kein kanonisches, stabiles Basenpaar, sondern im GC ein GU-Wobble-Basenpaar bildet (Abb. 5b), interagieren die Wasserstoffbrückenbindungen mit dem anderen Strang des Stamms, der die Nukleobase hält von G777 nach innen werden geschwächt, was es der Nukleobase ermöglicht, in EC2 herauszuklappen.

a 1Himino-1Himino NOESY-Spektren der StASL-Domäne (rot) und ihrer U778C-Variante (schwarz). Nur für die U778C-Variante beobachtete NOE-Signale werden mit ihren Zuordnungen in Blau angezeigt. b Sekundärstruktur des St-Oberstamms, bestimmt durch die NOESY-Experimente. c Temperaturabhängigkeit der 1H8-13C8-TROSY-Signale der StASL-Domäne (links) und ihrer U778C-Variante (rechts). Bei 10, 15, 20, 25, 30 und 35 °C aufgenommene Spektren werden jeweils in Braun, Violett, Orange, Rot, Grün und Blau angezeigt. In den Spektren der U778C-Variante wurde das Signal auf der extrapolierten Linie (grau) des Elternkonstrukts beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Gleichgewicht verschoben wurde, sodass die Konformationen, die bei niedrigeren Temperaturen stärker bevölkert sind, durch die U778C-Mutation stärker stabilisiert werden. d Vergleich der temperaturabhängigen Störungen der chemischen Verschiebung der Signale aus der ASL-Domäne mit den Mg2+-abhängigen Störungen der chemischen Verschiebung. (Links) Temperaturabhängige Störungen der chemischen Verschiebung der Signale von ASL in der StASL-Domäne. Spektren, die ohne Mg2+ bei 25, 30 und 35 °C aufgenommen wurden, werden in Rot, Grün bzw. Blau angezeigt. (Rechts) Mg2+-abhängige Störungen der chemischen Verschiebung der ASL-Domäne in JK-St bei 35 °C. Spektren, die mit Mg2+-Konzentrationen von 0, 1,2 und 2,5 mM aufgenommen wurden, werden in Blau, Orange bzw. Lila angezeigt. e Strukturvergleich der ASL-Domäne. (Links) Mg2+-ungebundene ASL-Struktur in der freien JK-St-Struktur (Grundzustand). (Rechts) Mg2+-gebundene ASL-Struktur im Mg2+-gebundenen Zustand im JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A-Komplex. Die Basen in der ASL-Domäne sind rot dargestellt, diejenigen, die an der Wechselwirkung mit Mg2+ beteiligt sind, sind blau.

Anschließend führten wir das 13C-SQ-Relaxationsdispersionsexperiment mit der StASL U778C-Variante durch (ergänzende Abbildung 12). Das Signal von G777 C8 wurde aufgrund der Einführung der U778C-Mutation bis zur Erkennung verbreitert, was möglicherweise die Verschiebung des Konformationsgleichgewichts widerspiegelt, wodurch es durch das Relaxationsdispersionsexperiment nicht analysierbar ist. Es wurde jedoch gezeigt, dass die Relaxationsdispersionskurven von G687, G690, A771 und A772, die im Wildtyp lineare Profile aufwiesen (Abb. 4b und ergänzende Abb. 8), in der U778C-Variante (ergänzende) nichtlineare Profile aufwiesen Abb. 12c). Diese Kurven konnten weder durch die schnelle Zwei-Zustands-Austauschgleichung24 noch durch die allgemeine Zwei-Zustands-Austauschgleichung29 angepasst werden, was darauf hindeutet, dass die Modulation im Konformationsgleichgewicht den für diese Basen offensichtlichen chemischen Austausch zwischen GS, ES1 und ES2 veränderte. Die globale Anpassung der Relaxationsdispersionskurven dieser Basen mit dem Drei-Zustands-Austauschmodell unter der Annahme von Wechselkursen, die denen des Wildtyps entsprechen, ergab, dass die Populationen von GS, ES1 und ES2 36,9 ± 3,1, 58,8 ± 2,9 und 4,3 betragen ± 0,1 % für diese Variante (ergänzende Abbildung 12d), was sich deutlich von den Populationen von 80,4 ± 2,9, 17,9 ± 2,9 und 1,7 ± 0,1 % unterscheidet, die für den Wildtyp beobachtet wurden (Abb. 4c). Diese Ergebnisse weisen quantitativ darauf hin, dass die U778C-Mutation die GS-Population verringert und gleichzeitig die Populationen von ES1 und ES2 erhöht, und stützen die Annahme, dass der obere Stamm der St-Domäne in ES1 und ES2 im Register verschoben ist.

Um die angeregte Konformation der ASL-Domäne zu charakterisieren, verglichen wir die temperaturabhängigen chemischen Verschiebungsänderungen mit den Mg2+-abhängigen chemischen Verschiebungsänderungen der Basen aus der ASL-Domäne (Abb. 5d). Interessanterweise zeigten die chemischen Verschiebungswerte von A771, A772, A773 und A774 in der StASL-Domäne bei Senkung der Temperatur von 35 °C auf 25 °C in Abwesenheit von Mg2+ praktisch identische Veränderungen wie die, die für diese Basen in JK- beobachtet wurden. St bei Änderung der Mg2+-Konzentration von 0 auf 2,5 mM bei 35 °C (Abb. 5d). Daher sind die Änderungen der chemischen Verschiebung der Basen in der ASL-Domäne bei Temperaturabsenkung identisch mit denen, die bei der Titration von Mg2+ beobachtet werden. Da eine Verringerung der Temperatur die Population der angeregten Konformation erhöht (Abb. 5c), sollte die angeregte Konformation der ASL-Domäne derjenigen der ASL-Domäne im Mg2+-gebundenen Zustand ähneln. In Anbetracht der Tatsache, dass zwei Mg2+-Ionen an Basentripel binden, die die Basen der ASL-Domäne in der Kryo-EM-Struktur des Komplexes einschließen (Abb. 5e), legen diese Ergebnisse nahe, dass die angeregte Konformation der ASL-Domäne ohne Mg2+ der Konformation der ASL-Domäne ähnlich ist Die ASL-Domäne bindet in der komplexen Struktur an Mg2+ und bildet so die Mg2+-Bindungsstellen, die durch die Mg2+-Bindung weiter stabilisiert werden.

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die ECs des oberen St-Stamms und der ASL-Domäne ähnliche Strukturmerkmale wie der eIF4GHEAT1-gebundene Zustand aufweisen, mit der wichtigen Beobachtung, dass die extrudierte Nukleobase G777 aus der Stapelwechselwirkung innerhalb des Stamms freigesetzt wird. Da der obere St-Stamm die Region ist, die direkt mit eIF4GHEAT1 interagiert, und G777 extrudiert wird, um mit der negativ geladenen Spalte davon zu interagieren, sind diese angeregten Konformationen, insbesondere EC2, in denen G777 nicht auf den anderen Basen gestapelt ist, günstig an den Wechselwirkungen beteiligt in der frühen Phase des komplexen Entstehungsprozesses. Darüber hinaus sollten die angeregten Konformationen der ASL-Domäne an der Drei-Wege-Verbindung, die dem eIF4GHEAT1-gebundenen Zustand ähneln, die Domänenorientierungen zu denen in der komplexen Struktur umordnen (Abb. 1h, 5e), wodurch die beiden eIF4GHEAT1-Bindungsstellen dazu gebracht werden optimale Positionen für gleichzeitiges Binden.

Als nächstes führten wir ITC-Experimente durch, um zu untersuchen, ob die für die beiden eIF4GHEAT1-Bindungsstellen in den J- und StASL-Domänen beobachtete Konformationsdynamik für die Interaktion mit eIF4GHEAT1 entscheidend ist (ergänzende Abbildung 13). Angesichts der Tatsache, dass die U778C-Mutation die Populationen der angeregten Konformationen erhöht, die die strukturellen Eigenschaften von JK-St wie in der komplexen Struktur aufweisen, könnte man erwarten, dass die JK-St-U778C-Variante eine ähnliche oder sogar stärkere Affinität dazu haben würde eIF4GHEAT1 im Vergleich zum Wildtyp. Die JK-St U778C-Variante zeigte jedoch eine verringerte Affinität für eIF4GHEAT1 mit einem Kd-Wert von mehr als 10 μM im Vergleich zu 149 ± 12 nM für den Wildtyp (Ergänzende Abbildungen 2a, 13b). Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass sich U778 in der komplexen Struktur an der Schnittstelle zu eIF4GHEAT1 befindet (Abb. 1g, 2a und ergänzende Abb. 14) und eine Mutation zu einer verringerten freien Energie bei Wechselwirkung mit eIF4GHEAT1 führen könnte, wodurch die Affinität für eIF4GHEAT1 verringert wird. Anschließend haben wir die Varianten A700C und U780C entworfen, um die in den NMR-Analysen beobachtete Konformationsdynamik in den J- und StASL-Domänen zu unterdrücken, ohne die Basen zu mutieren, die direkt mit eIF4GHEAT1 interagieren (ergänzende Abbildung 15). Für die J-Domäne würde die Änderung von A700 in Cytidin die kanonische Watson-Crick-Basenpaarbildung mit G723 ermöglichen, was die Plastizität der J-Domänenausbuchtung G723-A724 unterdrücken würde, um die Konformationsänderung im Komplexbildungsprozess zu ermöglichen (ergänzende Abb . 15a, b). Für die StASL-Domäne würde die Änderung von U780 in ein Cytidin die Basenpaarung mit G689 stabilisieren, da das kanonische Watson-Crick-GC-Basenpaar stabiler ist als das GU-Wobble-Basenpaar, was die Registerverschiebung in Richtung der angeregten Konformationen, die für erforderlich sind, unterdrücken würde Konformationsänderung im Komplexbildungsprozess (Ergänzende Abb. 15d, e). NMR-Rex-Analysen dieser isolierten Domänenvarianten ergaben, dass die Dynamik in der μs-ms-Zeitskala unterdrückt wird (ergänzende Abbildung 15c, f), während die Sekundärstrukturen dieser isolierten Domänen durch die Mutation nicht verändert werden (ergänzende Abbildung 15a, d). ). Die ITC-Experimente ergaben, dass die Varianten A700C und U780C von JK-St verringerte Affinitäten für eIF4GHEAT1 besitzen (ergänzende Abbildung 13a, b), was darauf hinweist, dass die Unterdrückung der Konformationsdynamik zur Stabilisierung der Bodenkonformation zu verringerten Affinitäten für eIF4GHEAT1 führt.

Schließlich wollten wir den Zusammenhang zwischen der Dynamik und der biologischen Funktion von IRES untersuchen. Zu diesem Zweck nutzten wir das humane zellfreie Translationssystem30, bei dem das EMCV IRES verwendet wird, um die Translation eines Reporterproteins, β-Galactosidase, zu initiieren, indem es mit den Translationsinitiationsfaktoren in der menschlichen Zelle interagiert (ergänzende Abbildung 13c). . Als Ergebnis wurde gezeigt, dass die Einführung von A700C-, U780C- oder U778C-Mutationen in das EMCV-IRES voller Länge die Proteinexpressionsniveaus auf 86,9 ± 3,2, 89,5 ± 3,4 bzw. 72,3 ± 3,4 % senkte, was die beobachtete Konformationsdynamik zeigt in den NMR-Analysen hängen mit der biologischen Funktion von IRES zusammen.

In dieser Studie haben wir die dreidimensionale Struktur des JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A-Komplexes durch Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse visualisiert (Abb. 1 und ergänzende Abb. 3 und 4). Diese Struktur bestätigte nicht nur die früheren biochemischen Berichte zu den Interaktionsstellen auf JK-St und eIF4GHEAT1 (ergänzende Abbildung 16) 10, 11, 12, sondern enthüllte auch Schlüsselmerkmale zu den restspezifischen Wechselwirkungen und Konformationsänderungen von JK-St , bei Interaktion mit eIF4GHEAT1. Die JK-St-Region bindet über zwei separate Stellen in den J- und St-Domänen an eIF4GHEAT1. Wir haben zuvor eine SAXS-Struktur mit niedriger Auflösung des JK-St- und eIF4GHEAT1-Komplexes vorgestellt und vorgeschlagen, dass die K- und St-Domänen die eIF4GHEAT1-Bindungsdomänen sind, unter der Annahme, dass das JK-St bei der Bindung an eIF4GHEAT1 9 keine strukturellen Veränderungen erfährt. Hier In der Kryo-EM-Struktur mit einer Auflösung von 3,7 Å haben wir deutlich gezeigt, dass JK-St über die J- und St-Domänen an eIF4GHEAT1 bindet, indem es ihre relativen Winkel anpasst, um an der Oberfläche von eIF4GHEAT1 zu haften (Abb. 1h), sich jedoch nicht wesentlich ändert die Gesamtstruktur von eIF4GHEAT1 (ergänzende Abbildung 5a). Dies ist eine wichtige Voraussetzung, um die Translationsmaschinerie des Wirts zu unterdrücken, da die Auslösung struktureller Veränderungen, die die Protein-Protein-Wechselwirkungen beeinträchtigen, in diesem Fall mit eIF4A, die effiziente Translation der viralen Proteine ​​zur Replikation beeinträchtigen würde. Um die spezifische Wechselwirkung des Zielproteins ohne Beeinträchtigung durch die Wechselwirkungen mit eIF4A zu erreichen, sollte JK-St die Oberfläche von eIF4GHEAT1 kontaktieren, das über verstreute positiv und negativ geladene Flecken und nur wenige freiliegende aromatische Reste verfügt (ergänzende Abbildung 1). . Dies ist eine völlig andere Situation als die RNA-Protein-Wechselwirkungen, an denen kanonische RNA-bindende Proteine16,17,18 beteiligt sind, die basische und aromatische Reste verwenden, um Grenzflächen zu bilden, die ideal für elektrostatische und π-π-Stapelwechselwirkungen mit negativ geladener RNA sind und hocharomatisches Molekül (Ergänzende Abbildung 1).

EMCV IRES ermöglicht diese Interaktion durch die Verwendung der beiden Stammdomänen J und St, die jeweils auf die beiden kleinen Flecken auf dem Zielprotein zugeschnitten sind. Wichtig ist, dass keine dieser Domänen an das isolierte eIF4GHEAT1 binden kann (ergänzende Abbildung 2d, e), möglicherweise weil der Energiegewinn, der durch die Bindung einer Domäne erzielt wird, durch die begrenzten Wechselwirkungen mit dem kleinen Patch nicht ausreicht, um einen stabilen Komplex zu bilden. Die J-Domäne interagiert mit einer kleinen positiv geladenen Oberfläche mit den Hauptkettenatomen und einer negativ geladenen Spalte mit der extrudierten Nukleobase A724 (Abb. 1f). Unsere 13C-SQ-Relaxationsdispersionsanalysen zeigten die Konformationsdynamik für die Ausbuchtungen der J-Domäne, die durch die eIF4GHEAT1-Bindungsreste gebildet werden (Abb. 3a). Dies könnte wichtig sein, um eine Plastizität zu erreichen, die zur Ladungsverteilung auf der Oberfläche des Ziels passt. Wir fanden auch heraus, dass A724 durch das Konformationsgleichgewicht in Abwesenheit von eIF4GHEAT1 nur minimal gestört wird, was darauf hindeutet, dass das Herausklappen der Nukleobase erst erfolgt, nachdem die Wechselwirkungen mit den anderen eIF4GHEAT1-bindenden Basen gebildet wurden, was A724 in die optimale Position führen würde mit der Spalte interagieren. Unterdessen dockt die St-Domäne an einen weiteren positiv geladenen Fleck auf eIF4GHEAT1 an, ebenfalls hauptsächlich über die Hauptkettenatome. In diesem Fall interagiert die extrudierende Nukleobase G777 mit einer relativ flachen, negativ geladenen Spalte (Abb. 1g). Da der durch Extrusion von G777 gebildete Hohlraum in der St-Domäne durch einen Lysinrest, Lys826, von eIF4GHEAT1 gefüllt wurde (ergänzende Abbildungen 5c, 14), ist das Herausklappen von G777 nicht nur für seine direkte Wechselwirkung mit eIF4GHEAT1 wichtig, sondern auch auch für die Bildung der Bindungstasche für diesen Grundrest. Die 13C-SQ-Relaxationsdispersionsexperimente zeigten, dass der obere St-Stamm in einem Konformationsgleichgewicht vorliegt. In den angeregten Konformationen EC1 und EC2 ist der obere St-Stamm registerverschoben, während G777 mehr bzw. weniger basengestapelt ist. Die Registerverschiebung und die schwächere Stapelung von G777 stützen die Annahme, dass EC2, das in Abwesenheit von eIF4GHEAT1 in einer geringen Population von 1,7 % existiert (Abb. 4c), Strukturmerkmale der gebundenen Zustandskonformation besitzt und möglicherweise daran beteiligt ist erster Schritt des komplexen Entstehungsprozesses.

Die beiden eIF4GHEAT1-Bindungsdomänen J und St werden durch die von der ASL-Domäne gebildete Drei-Wege-Verbindung konsolidiert. Unsere 13C-SQ-Relaxationsdispersionsexperimente zeigten auch, dass sich die ASL-Domäne in einem Konformationsgleichgewicht befindet, das mit dem oberen St-Stamm gekoppelt ist (Abb. 4b, c und ergänzende Abb. 8–10). Ein Vergleich der chemischen Verschiebungen ergab, dass die angeregten Konformationen der ASL-Domäne in Abwesenheit von Mg2+ und eIF4GHEAT1 der Mg2+-gebundenen Konformation in Abwesenheit von eIF4GHEAT1 ähnlich sind (Abb. 5d, e). Da Mg2+ an die ASL-Domänenregion im JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A-Komplex gebunden ist, ist es möglich, dass diese ASL-Struktur im Komplex die angeregte Konformation der ASL-Domäne in Abwesenheit von Mg2+ und eIF4GHEAT1 darstellt. Dies legt nahe, dass die angeregten Konformationen der ASL-Domäne an der Drei-Wege-Verbindung die J- und St-Domänen durch die intramolekularen Wechselwirkungen mit den anderen Domänen in geeignete Positionen bringen, um gleichzeitig an die beiden Patches auf der eIF4GHEAT1-Domäne anzudocken (Abb. 1h, 5e).

Insgesamt nutzt die JK-St-Region zwei Interaktionsstellen, um ihr Zielprotein eIF4G einzufangen, hauptsächlich durch Änderung des Winkels zwischen den J- und St-Stammdomänen (Abb. 1h, 6). Diese beiden Stellen interagieren gemeinsam am Zielprotein, und die Bindung kann nicht durch eine einzelne Domäne erreicht werden (ergänzende Abbildungen 2a, d, e). Die dynamischen Vorschriften können für jede Bindungsstelle auf eIF4GHEAT1 angepasst werden. Wichtig ist, dass auch die relative Ausrichtung dieser beiden Stellen genau organisiert sein sollte, damit sie gleichzeitig mit ihren jeweiligen Bindungsstellen interagieren können. Daher sollten auch die Struktur und Dynamik der ASL-Domäne an der Drei-Wege-Verbindung, die nicht direkt mit eIF4GHEAT1 interagiert, eine grundlegende und wichtige Rolle bei der Interaktion spielen, indem sie die relative Ausrichtung und den Abstand dieser beiden Bindungsstellen anpassen. Wir gehen davon aus, dass diese Erkenntnisse über die Funktion und den Mechanismus des viralen IRES die Entwicklung neuartiger Therapeutika erleichtern werden, die die Virusreplikation verhindern, indem sie die Interaktionen zwischen IRES und Wirtsprotein hemmen.

In JK-St befindet sich die J-Domäne im Konformationsgleichgewicht zwischen mehreren Konformationen, wobei die Basenpaarungsmuster in der Ausbuchtungsregion unterschiedlich sind. Die Stammregionen in der J-Domäne sind im Gleichgewicht nicht gestört (oben). Die St- und ASL-Domänen befinden sich im konzertierten Konformationsgleichgewicht zwischen der Grundkonformation, der angeregten Konformation 1 und der angeregten Konformation 2 (unten). Durch die Registerverschiebung des St-Oberstamms und die Konformationsänderung in der ASL-Domäne kommt es zu einer Neuordnung der Domänenorientierung der J-, K- und St-Domänen in den angeregten Konformationen, sodass JK-St eine optimale Struktur für die Gleichzeitigkeit annimmt Zwei-Site-Interaktion der J- und St-Domänen, erforderlich für die Bindung von JK-St an eIF4GHEAT1.

Die Plasmide für die In-vitro-RNA-Transkriptionsreaktionen wurden konstruiert, indem PCR-amplifizierte DNA-Sequenzen, die den T7-Promotor (TAATACGACTCACTATA) enthielten, gefolgt von der interessierenden Sequenz, mithilfe von InFusion in pUC19 (Takara 3219) zwischen den BamHI- und EcoRI-Restriktionsstellen eingefügt wurden Reaktionen (Takara-Clontech 639648). Die RNA-Sequenzen waren: JK-St, 5'-GGGGCUGAAGGAUGCCCAGAAGGUACCCCAUUGUAUGGGAUCUGAUCUGG GGCCUCGGUGCACAUGCUUUACAUGUGUUUAGUCGAGGUUAAAAAACGUCUAGGCCCC-3′; J-Domäne, 5′-gggCAGAAGGUACCCCAUUGUAUGGGAUCUGAUCUGccc-3′; StASL-Domäne, 5′-GGGCUGAAGGAUGCCCAGcuucggCUGGGGCCUCGuucgCGAGGUUAAAAAA CGUCUAGGCCC-3′; und St-extended JK-St, 5′- gggaaau GGGGCUGAAGGAUGCCCAGAAGGUACCCCAUUGUAUGGGAUCUGAUCUGG GGCCUCGGUGCACAUGCUUUACAUGUGUUUAGUCGAGGUUAAAAAACGUCUAGGCCCCauuuccc −3′, wobei die nichtnativen Nukleotide in Kleinbuchstaben dargestellt sind.

Die Plasmide für die Expression der Enzyme, die zur Herstellung isotopenmarkierter rNTPs verwendet werden, wurden aus dem Escherichia coli DH5α-Genom amplifiziert und in einen auf pET28a(+) (Novagen 69864) basierenden Vektor eingefügt, in den stille Mutationen zur Erhöhung der Expressionsniveaus eingebaut wurden in die 5′-untranslatierte Region31 und ein MQLGHNHNHNHNHNHN-Tag wurde am N-Terminus der translatierten Region mithilfe von InFusion-Reaktionen hinzugefügt. Die klonierten Enzyme waren Ribosephosphatpyrophosphokinase (PRPPS, UniProt P0A717), Ribokinase (RK, UniProt P0A9J6), Adeninphosphoribosyltransferase (APRT, UniProt P69503), Guanylatkinase (GMK, UniProt P60546), Xanthin-Guaninphosphoribosyltransferase (XGPRT, UniProt). P0A9M5), Uracil-Phosphoribosyltransferase (UPRT, UniProt P0A8F0), Uridylatkinase (UMPK, UniProt P0A7E9) und CTP-Synthetase (CTPS, UniProt P0A7E5).

ORF/cDNA-Klone von menschlichem eIF4G (UniProt Q04637) und menschlichem eIF4A (UniProt P60842) wurden von DNAFORM (Yokohama, Japan) gekauft. Die Sequenz der HEAT1-Domäne (Reste 746–992) von eIF4G wurde durch PCR amplifiziert und unter Verwendung der XhoI- und SalI-Restriktionsstellen in den pCold I-Vektor (Takara-Clontech 3361) kloniert. Die vollständige Sequenz von eIF4A wurde durch PCR amplifiziert und über eine SLiCE-Reaktion32 in einen modifizierten pET28-Vektor (Novagen 69864) mit einem N-terminalen Octa-Histidin-Tag und einer humanen Rhinovirus-3C-Proteasestelle kloniert.

Die Sequenzen der bei der Klonierung verwendeten Primer werden als Zusatzdaten 1 bereitgestellt. Alle Sequenzen der konstruierten Plasmide wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

BL21(DE3)-Zellen (ThermoFisher Scientific C600003), transformiert mit dem Plasmid mit den für die Enzyme kodierenden Genen, wurden in 200 ml LB-Medium mit 50 mg/L Kanamycin 16 Stunden lang bei 37 °C kultiviert. Die Kultur wurde in 2 l LB-Medium mit 50 mg/l Kanamycin überführt und die Zellkultur bei 37 °C fortgesetzt, bis eine OD600 von 2 erreicht war. Anschließend wurde die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert und die Zellkultur 3–4 Stunden lang fortgesetzt. Die Zellen wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 10.150 × g gesammelt und in 200 ml Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl und × 1 Proteaseinhibitor-Cocktail (Nacalai Tesque 03969-21) enthielt. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen und 30 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf 10 ml Ni-NTA-Agaroseharz (QIAGEN 30230) aufgetragen. Das Harz wurde gründlich mit 300 ml Puffer gewaschen, der 50 mM NaPi (pH 8,0), 300 mM NaCl, 1 mM DTT und 10 mM Imidazol enthielt. Die Enzyme wurden vom Harz mit einem Puffer eluiert, der 50 mM NaPi (pH 8,0), 300 mM NaCl, 1 mM DTT und 300 mM Imidazol enthielt. Die die Enzyme enthaltenden Fraktionen wurden dann gepoolt und gegen Puffer dialysiert, der 50 mM NaPi (pH 7,4), 300 mM NaCl, 1 mM DTT und 10 % Glycerin enthielt. Nach der Dialyse wurden die Proben mit einem Amicon-Ultra15-Filter (10 kDa Cutoff, Merck UFC901024) konzentriert und Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 40 % zugegeben. Anschließend wurden die Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Das [{1′, 2′, 3′, 4′, 5′, 5′′}-2H, 13C8] ATP wurde enzymatisch unter Verwendung von D-[1, 2, 3, 4, 5, 5′-2H6 synthetisiert ] Ribose (Omicron Biochemicals RIB-040) und 13C8-Adenin (Cambridge Isotope Laboratories CLM-1654-PK) als Substrate mit dem dATP-Regenerationssystem33. Bei der Reaktion wurden hausintern gereinigtes RK, PRPPS und APRT verwendet, zusätzlich zu Kreatinkinase aus Kaninchenmuskel (CK, Roche 10127566001), Myokinase aus Kaninchenmuskel (MK, Sigma-Aldrich M3003) und thermostabiler anorganischer Pyrophosphatase ( TIPP, New England Biolabs M0296L). Das [{1′, 2′, 3′, 4′, 5′, 5′′}-2H, 13C8]-GTP wurde enzymatisch unter Verwendung von D-[1, 2, 3, 4, 5, 5′-2H6 synthetisiert ] Ribose (Omicron Biochemicals RIB-040) und 13C8 Guanin (Cambridge Isotope Laboratories CLM-1019-PK) als Substrate, mit dem dATP-Regenerationssystem33. Zusätzlich zu CK, MK und TIPP wurden in der Reaktion hausintern gereinigtes RK, PRPPS, XGPRT und GMK verwendet.

Deuteriertes Uracil wurde durch Erhitzen einer Mischung aus 150 mg Uracil in natürlicher Häufigkeit, 15 mg Palladium auf Kohlenstoff (Sigma 205680-10 G) und 30 ml D2O unter einer H2-Atmosphäre bei 160 °C für 24 Stunden34 hergestellt. Die Reaktion wurde filtriert und das Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt. Das u-2H UTP wurde enzymatisch unter Verwendung von D-[1, 2, 3, 4, 5, 5′-2H6] Ribose (Omicron Biochemicals RIB-040) und dem deuterierten Uracil als Substrate mit dem dATP-Regenerationssystem 35 synthetisiert. Zusätzlich zu CK, MK und TIPP wurden hausintern gereinigtes RK, PRPPS, UPRT und UMPK verwendet. Das u-2H-CTP wurde durch Umwandlung des u-2H-UTP mit CTPS unter Verwendung von NH4Cl als Substrat35 erhalten.

Nach der Reaktion wurden die Proben durch einen Amicon-Ultra 15 (30 kDa Cutoff, Merck UFC903024) filtriert, um die Proteinkomponenten zu entfernen, lyophilisiert und erneut in Wasser aufgelöst. Der pH-Wert jeder Probe wurde vor der Anwendung auf Affi-Gel Boronat-Gelharz (Bio-Rad 1536103) auf 9–10 eingestellt. Das Harz wurde mit einer 1 M Triethylammoniumhydrogencarbonatlösung (TEAB, FUJIFILM Wako Pure Chemical 208-08385) gewaschen und die isotopenmarkierten rNTPs wurden mit CO2-angesäuertem Wasser (pH 4,6) eluiert. Die die rNTPs enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt, lyophilisiert, erneut in Wasser gelöst und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert.

Die Plasmide für die In-vitro-RNA-Transkription wurden als Matrizen für PCR-Reaktionen verwendet, um die Regionen zu amplifizieren, die den T7-Promotor und die interessierende Sequenz enthalten. Die Sequenzen der beim Klonen verwendeten Primer werden als ergänzende Daten bereitgestellt. Für JK-St und die StASL-Domäne wurden die beiden 5'-terminalen Nukleotide des Reverse-Primers 2'-O-methyliert, um die Heterogenität an den 3'-Enden der Transkripte zu unterdrücken36. Die PCR-Produkte wurden mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und mit Isopropanol präzipitiert. RNA-Proben wurden durch In-vitro-Transkription unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase und der PCR-amplifizierten Matrizen-DNA erhalten. Die isotopenmarkierten rNTPs wurden für die mit [u-2H, Ade-{1H2, 1H8, 13C8}, Gua-{1H8, 13C8}] markierten RNA-Proben verwendet. Nach der Transkription wurde die Reaktion durch Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 25 mM und Hitzedenaturierung gestoppt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Probe wurde dann mit einem Amicon-Ultra 15-Filter (3 kDa Cutoff, Merck UFC900324) konzentriert und mit Harnstoff-denaturierenden Polyacrylamid-Scheibengelen (National Diagnostics EC-835 und EC-840) unter Verwendung einer elektroosmotischen Mediumpumpe37 gereinigt. Die Fraktionen, die die RNA-Probe enthielten, wurden gepoolt und mit Microcep Advance-Filtern (Pall MCP003C41) konzentriert und dann fünfmal mit 1 M NaCl gewaschen, bevor der Puffer für weitere Anwendungen ausgetauscht wurde.

Humanes eIF4GHEAT1 wurde im Stamm E. coli BL21 (DE3) (Merck 69450) durch Induktion mit 1 mM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) exprimiert und die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 15 °C gezüchtet. Die geernteten Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung in Puffer A (20 mM Tris, pH 7,5 und 10 % Glycerin (v/v)) aufgeschlossen, der 300 mM KCl, 10 μg/ml DNase I, 0,5 mM PMSF und einen vollständigen Proteaseinhibitor-Cocktail enthielt Tablette (Roche 11697498001). Nach 45-minütiger Zentrifugation bei 70.000 g wurde der Überstand durch TALON-Metallaffinitätsharz (Takara-Clontech 635504) geleitet. Das Harz wurde mit Puffer A, der 800 mM KCl enthielt, und anschließend mit Puffer A, der 100 mM KCl und 10 mM Imidazol enthielt, gewaschen. Das Protein wurde mit Puffer A eluiert, der 100 mM KCl und 300 mM Imidazol enthielt. Das eIF4GHEAT1-Protein wurde durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer Superdex 75 Erhöhung 10/300-Säule (Cytiva 29148721) mit Puffer, der 20 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM KCl, 5 % Glycerin (v/v), 0,1 mM enthielt, weiter gereinigt EDTA und 2 mM DTT. Gepoolte Peakfraktionen wurden mit einem Amicon-Ultra 4-Filter (3 kDa Cutoff, Merck UFC800324) auf ~250 μM konzentriert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert.

Menschliches eIF4A in voller Länge wurde im Stamm E. coli BL21 Star (DE3) (Thermo Fisher Scientific C601003) exprimiert, mit 1 mM IPTG induziert und 4 Stunden lang bei 37 °C gezüchtet. Die geernteten Zellen wurden lysiert und das Protein wie oben beschrieben mit TALON-Harz gereinigt. Das eluierte Protein wurde gegen Q-Ladepuffer (20 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 5 % Glycerin (v/v), 0,1 mM EDTA und 2 mM DTT) dialysiert. Die Probe wurde auf eine 1-ml-RESOURCE-Q-Säule (Cytiva 17117701) aufgetragen, die mit Q-Ladepuffer äquilibriert war. Das eIF4A-Protein wurde mit einem linearen KCl-Gradienten von 100 mM bis 400 mM eluiert. Gepoolte Peakfraktionen wurden mit einem Amicon-Ultra 4-Filter (10 kDa Cutoff, Merck UFC801024) auf ~170 μM konzentriert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert.

Um die St-Domäne eindeutig von den anderen J- und K-Domänen in den erhaltenen EM-Karten zu unterscheiden und die Größe des Komplexes zu erhöhen, wurde zusätzlich St-verlängertes JK-St hergestellt, bei dem die St-Domäne um sieben Basenpaare verlängert ist JK-St (Ergänzende Abbildung 2c). Die Wildtyp- und St-extended-JK-St-RNA-Proben wurden gegen Puffer dialysiert, der 40 mM Kaliumphosphat, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,2 mM EDTA und 5 mM DTT enthielt, und auf ~200 μM konzentriert. Der ternäre JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A-Komplex wurde durch Mischen der JK-St-RNA mit den aufgetauten eIF4GHEAT1- und eIF4A-Proteinen in einem Molverhältnis von 1,07:1:1,13 gebildet. Die Probe wurde mit 100x ATP-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 1 mM gemischt, 10 Minuten auf Eis inkubiert und dann auf eine Superdex 200 Erhöhung 10/300-Säule aufgetragen, äquilibriert mit Puffer, der 20 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM KCl enthielt , 2 mM MgCl2, 100 μM ATP und 1 mM DTT. Die Absorption bei 260 nm der Fraktion mit dem oberen Peak, die den Komplex enthielt, betrug ~3,2, und 3,5-μl-Aliquots der Fraktion wurden auf Quantifoil R1.2/1.3 300 Mesh Au-Gitter aufgetragen, 3 Sekunden lang bei 4 °C geblottet und durch Eintauchen getrocknet. in flüssigem Ethan mit einem Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) eingefroren. Erste Kryo-EM-Daten wurden manuell bei 300 kV mit einem JEM-Z300CF-Elektronenmikroskop (JEOL) gesammelt, das mit einem K2 Summit-Direktelektronendetektor (Gatan) im Elektronenzählmodus ausgestattet war. Die kalibrierte Pixelgröße betrug 0,98 Å auf Probenebene, und Belichtungen von 8 Sekunden wurden in 40 Bilder mit einem Elektronenfluss von 8 e-/Pixel/Sekunde dosisfraktioniert. Größere Kryo-EM-Daten des Komplexes, der die St-verlängerte JK-St-RNA enthält, wurden bei 300 kV mit einem JEM-Z320FHC-Elektronenmikroskop (JEOL) gesammelt, das mit einem K2 Summit-Direktelektronendetektor im Elektronenzählmodus ausgestattet war, unter Verwendung von SerialEM38. Die kalibrierte Pixelgröße betrug 0,765 Å auf Probenebene, und Belichtungen von 8 Sekunden wurden in 40 Bilder mit einem Elektronenfluss von 5 e-/Pixel/Sekunde dosisfraktioniert.

Die Bildverarbeitung wurde mit RELION-3.139,40 durchgeführt. Die Probenbewegung wurde mit MotionCor241 korrigiert, die Parameter der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) wurden mit Gctf42 geschätzt und Bilder, die erhebliche Eiskontamination, abnormale Hintergründe oder schlechte Thon-Ringe zeigten, wurden verworfen. Die Partikel wurden zunächst mit Gautomatch (https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/) ohne Vorlagen ausgewählt und anschließend wurden die ausgewählten Partikel einer 2D-Klassifizierung unterzogen. Fünf repräsentative Klassendurchschnitte wurden als Vorlagen für Gautomatch ausgewählt, um Partikel aus allen auf JEM-Z320FHC gesammelten Mikroaufnahmen auszuwählen. Die automatisch ausgewählten Partikel wurden mit einer Neuskalierung von Bildern mit 300 × 300 auf 100 × 100 Pixel extrahiert und zwei Bereinigungsrunden der 2D-Klassifizierung unterzogen. Eine erste Referenzkarte wurde in RELION erstellt und dann als Referenz für die 3D-Klassifizierung der bereinigten Partikel in vier Klassen verwendet, von denen eine ausgewählt und zum erneuten Extrahieren der entsprechenden Partikel in 200 × 200 Pixel große Bilder verwendet wurde. Die anschließende 3D-Verfeinerung mit C1-Symmetrie, CTF-Verfeinerung und Bayes'scher Politur ergab eine Karte mit einer Auflösung von 3,8 Å. Eine weitere 3D-Verfeinerung durch lokale Ausrichtung mit einer Maske in einem besser geordneten Bereich ergab eine fokussierte Karte mit einer Auflösung von 3,7 Å (ergänzende Abbildung 3).

Die Kryo-EM-Modelle von eIF4GHEAT1 und eIF4A im menschlichen 48S-Translationsinitiationskomplex (PDB-ID: 6ZMW)43 wurden verwendet und passten in die Kryo-EM-Karte von UCSF Chimera44, ohne die heterodimere Konfiguration zu stören. Weitere Anpassungen und Anpassungen wurden manuell in COOT durchgeführt, indem das Kettenverfeinerungsmodul mit selbstlokalen Abstandsbeschränkungen verwendet wurde45. Das NMR-Modell von JK-St (PDB-ID: 2NBX)9 wurde von UCSF Chimera manuell in die Kryo-EM-Karte eingepasst, zunächst basierend auf der Struktur der J-Domäne. Aufgrund der großen Konformationsänderungen an der Dreiwegeverbindung und der ASL-Domäne passten die K- und St-Domänen nicht gut in die Dichte. Daher wurden die beiden Domänen durch Entfernen der Reste in der Verbindungsregion aus dem Modell getrennt und dann durch UCSF Chimera einzeln in die Dichte eingepasst. Das Modell wurde in COOT manuell angepasst und verfeinert und die entfernten Reste wurden de novo erstellt. Die Modelle der Proteine ​​und der RNA wurden kombiniert und iterative Zyklen der Realraumverfeinerung in PHENIX46 mit Sekundärstrukturbeschränkungen und manuellen Anpassungen wurden an der gesamten komplexen Karte durchgeführt, wodurch das Kryo-EM-Modell des ternären Komplexes entstand. Das endgültige Modell von JK-St/eIF4GHEAT1 wurde durch weitere Verfeinerung der fokussierten Karte in PHENIX erhalten. Die Verfeinerungsstatistiken sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Die Strukturen werden mit PyMol oder UCSF ChimeraX47 gerendert.

Für NMR-Experimente wurden die RNA-Proben in NMR-Puffer (10 mM NaPi (pH 6,4), 10 mM KCl) gelöst. Anschließend wurden die Proben lyophilisiert und im gleichen Volumen 99,96 % D2O (Cambridge Isotope Laboratories DLM-4-10×0,7) erneut aufgelöst. Alle NMR-Spektren wurden mit den Spektrometern Bruker Ascend Evo 1,0 GHz, Bruker Avance 900, Bruker Avance 800 und Bruker Avance 600 aufgenommen, die mit einer kryogenen Sonde ausgestattet waren. Zweidimensionale 1H-13C-aromatische TROSY-Spektren wurden mithilfe der selektiven Spinzustands-Kohärenzübertragung21 in nicht konstanter Zeit aufgenommen. Die Zuordnungen der 1H8-13C8-HMQC-Signale aus der J-Domäne sind in der Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB) unter dem Zugangscode 25997 verfügbar. Unterschiede in den chemischen 13C8-Verschiebungen aufgrund der Auswahl der TROSY-Komponenten in der 13C-Dimension in Die 1H8-13C8-TROSY-Spektren werden berücksichtigt, um die in dieser Studie verwendeten Zuordnungen zu erhalten. Für die StASL-Domäne wurden die 1H-1H-NOESY-Spektren in D2O unter Bezugnahme auf unseren vorherigen Bericht für die ΔJΔK-Domäne9 analysiert, deren chemische Verschiebungen im BMRB unter dem Zugangscode 26000 verfügbar sind. Die chemischen Verschiebungswerte der 1H8-Signale des ΔJΔK Domäne wurden verwendet, um 13C8-aromatische TROSY-Signale in der StASL-Domäne zuzuordnen, indem entsprechende Signale im 1H8-13C8-aromatischen TROSY-Spektrum gefunden wurden.

Die 13C-Einzelquantenrelaxationsdispersionsexperimente wurden bei 30 °C unter Verwendung einer TROSY-basierten Pulssequenz23 mit einer Phasenmodifikation im spinzustandsselektiven Inversionselement während der Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)-Pulsfolge48 aufgezeichnet. Die Rex-Werte wurden bei der 13C-Frequenz von 200 MHz erhalten, wobei die CPMG-Relaxationsperioden auf 30 ms für die StASL-Domäne bzw. 40 ms für die J-Domäne eingestellt wurden. Die CPMG-Frequenzen, νCPMG, wurden für die StASL-Domäne auf 33,3 und 1.500 Hz und für die J-Domäne auf 25 und 1.500 Hz eingestellt. Für die Relaxationsdispersionsanalysen der StASL-Domäne wurden die CPMG-Relaxationsperioden mit konstanter Zeit auf 16 und 30 ms bei der 13C-Frequenz von 250 bzw. 150 MHz eingestellt. Die νCPMG-Werte variierten zwischen 62,5 Hz und 2000 Hz und 33,3 Hz und 2000 Hz bei der 13C-Frequenz von 250 bzw. 150 MHz. Alle Daten wurden mit Topspin 4.0.8 (Bruker) verarbeitet

Die Werte der effektiven Relaxationsraten, die in Gegenwart einer νCPMG Hz CPMG-Pulsfolge gemessen wurden, R2,eff(νCPMG), wurden unter Verwendung von Gl. 1, wobei I(νCPMG) und I(0) die Peakintensitäten mit bzw. ohne Relaxationsperiode T darstellen.

Die Unsicherheiten von R2,eff(νCPMG) [σR2,eff(νCPMG)] wurden mit Gleichung berechnet. (2), wobei Δ(νCPMG) den Rauschpegel bei νCPMG darstellt.

Zur globalen Anpassung wurden die mit zwei statischen Magnetfeldern erhaltenen 13C-SQ-Relaxationsdispersionskurven gleichzeitig an die Gleichung für den schnellen Zwei-Zustands-Austausch (Gleichung 3)24 angepasst

Dabei bezeichnet Φ den Dispersionsamplitudenparameter, R2,0 die intrinsische transversale Relaxationsrate, kex die Austauschrate, Δω die chemische Verschiebungsdifferenz und pB die Nebenzustandspopulation. Anpassungsverfahren wurden unter Verwendung des L-BFGS-B-Algorithmus durchgeführt, der in der Optimierungsfunktion in R (Version 4.2.1) implementiert ist. Die Unsicherheiten in den angepassten Austauschparametern wurden durch 100 Jackknife-Simulationen geschätzt, bei denen zwei Punkte zufällig aus jeder Relaxationsdispersionskurve entfernt wurden.

Für G777 wurden die mit zwei statischen Magnetfeldern erhaltenen 13C-SQ-Relaxationsdispersionskurven numerisch an das 3-Zustands-Austauschmodell zwischen den Konformationen A, B und C angepasst, wobei Konformation A der Hauptkonformation im oben genannten 2-Zustandsmodell entspricht ( Gleichung 4),

wobei M(0) proportional zum Vektor [pA, pB, pC]T ist, \({{{{{\bf{M}}}}}}}\left(T\right)={\left( {{{{{{\bf{A}}}}}}}_{\pm }{{{{{{\bf{A}}}}}}}_{\mp }{{{{{{ \bf{A}}}}}}}_{\mp }{{{{{{\bf{A}}}}}}}_{\pm }\right)}^{n}{{{{ {{\bf{M}}}}}}}\left(0\right)\) und n ist die Anzahl der 180°-Pulse in der CPMG-Pulsfolge. Die Matrix A ist wie folgt definiert (Gl. 5 und 6):

Dabei bezeichnet kXY die Austauschrate von der Konformation X. Die Austauschrate zwischen den Konformationen A und B der oben genannten globalen Anpassung wurde als Konstante in der Anpassung verwendet. Die Unsicherheiten in den Austauschparametern wurden aus einem Satz von 100 Ergebnissen der Anpassungsberechnungen geschätzt, bei denen die Anfangsparameter variiert wurden. Die erhaltenen Parameter wurden dann in den Linienformanalysen verwendet und bestätigten, dass die angepassten Austauschparameter die experimentell beobachteten Signale erklären.

Vor allen Experimenten zur isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) wurden eIF4GHEAT1 und RNAs in ITC-Puffer (20 mM HEPES-NaOH, pH 6,5, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2 und 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid) gelöst. wenn nicht anders angegeben. Für jedes ITC-Experiment wurden Reaktionswärmen (in µcal s-1) für 2-µl-Titrationen von 150–250 µM eIF4GHEAT1 in 10–20 µM RNA bei 25 °C mit einem Microcal PEAQ-ITC (Malvern) gemessen. Die Titrationsdaten wurden unter Verwendung des One-Site-Bindungsmodells von MicroCal PEAQ-ITC Analysis Software (Malvern) analysiert. Die Kd-Werte werden angegeben, wenn der c-Wert, der das Verhältnis der RNA-Konzentration zum berechneten Kd-Wert darstellt, kleiner als 5 ist. Fehlerwerte stellen den Standardfehler der ITC-Anpassung dar. Die Experimente zur Interaktion zwischen dem JK-St-Wildtyp und dem eIF4GHEAT1-Wildtyp in Gegenwart von 2 mM Mg2+ wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Alle anderen Experimente wurden mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

PAGE-Gele mit 12 % Acrylamid wurden unter Verwendung einer 30 %igen Acrylamid/Bis-Lösung (29:1) in 1x TBE-Puffer (89 mM Tris-HCl, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,3) hergestellt. Die Elektrophorese wurde in 1x TBE-Puffer bei einem konstanten Strom von 10 mA bei 4 °C für 1,5 Stunden durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit einer Stains-all-Lösung (Sigma E9379-1G) gefärbt.

Für die transkriptionsgekoppelte IRES-abhängige Translation des Reporterproteins β-Galactosidase wurde ein humanes zellfreies Expressionssystem (TaKaRa 3281) verwendet. Das DNA-Konstrukt, das EMCV IRES und β-Galactosidase enthält (geliefert als positiver Kontrollvektor von TaKaRa 3281), wurde als Matrize verwendet, um die Varianten A700C, U778C und U780C durch PCR-basierte Mutagenese zu erhalten. Diese Wildtyp- und mutierten DNA-Konstrukte wurden als Matrizen für In-vitro-T7-Transkriptions-Translations-Reaktionen gemäß den Anweisungen des Herstellers in einer Endkonzentration von 15 ng/µl in einem 10-µl-Reaktionsmaßstab verwendet. Nach 3-stündiger Inkubation bei 32 °C wurde EDTA bis zur Endkonzentration von 25 mM zugegeben. Die Menge der exprimierten β-Galactosidase wurde mit dem Luminescent β-Galactosidase Detection Kit II (Clontech 631712) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Die Lumineszenz wurde mit einem Envision 2104 Multilabel-Plattenlesegerät (PerkinElmer) gemessen. Die Experimente wurden sieben Mal wiederholt und Mittelwerte und Standardfehler werden angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Kryo-EM-Dichtekarte und die entsprechenden Atomkoordinaten des JK-St/eIF4GHEAT1/eIF4A-Komplexes wurden in der Electron Microscopy Data Bank und der Protein Data Bank unter den Zugangscodes EMD-35041 bzw. 8HUJ hinterlegt. Die fokussierte Kryo-EM-Dichtekarte und die entsprechenden Atomkoordinaten des JK-St/eIF4GHEAT1-Komplexes wurden unter den Zugangscodes EMD-36046 bzw. 8J7R hinterlegt. Weitere in dieser Studie verwendete Strukturdaten sind in der Proteindatenbank unter den Zugangscodes 2NBX, 2NBY, 2NC1, 6ZMW, 1HU3, 6GC5, 4PMI, 6HTU und 2VSO verfügbar. Die chemischen Verschiebungsdaten der StASL- und J-Domäne wurden im BMRB unter den Zugangscodes 51905 bzw. 51906 hinterlegt. Die in dieser Studie verwendeten Daten zur chemischen Verschiebung sind beim BMRB unter den Zugangscodes 25997 und 26000 erhältlich. Die in dieser Studie verwendeten Proteinsequenzen sind bei Uniprot unter den Zugangscodes P0A717 (PRPPS), P0A9J6 (RK), P69503 (APRT), P60546 erhältlich (GMK), P0A9M5 (XGPRT), P0A8F0 (UPRT), P0A7E9 (UMPK), P0A7E5 (CTPS), Q04637 (eIF4G) und P60842 (eIF4A). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Benutzerdefinierte Codes zur Anpassung der Relaxationsdispersionsdaten sind bei Zenodo unter https://doi.org/10.5281/zenodo.8166504 verfügbar.

Lee, KM, Chen, CJ & Shih, SR Regulationsmechanismen der viralen IRES-gesteuerten Translation. Trends Mikrobiol. 25, 546–561 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Komar, AA & Hatzoglou, M. Erforschung interner Ribosomeneintrittsstellen als therapeutische Ziele. Vorderseite. Onkol. 5, 233 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gebauer, F. & Hentze, MW IRES unplugged. Wissenschaft. 351, 228 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Weingarten-Gabbay, S. et al. Vergleichende Genetik. Systematische Entdeckung cap-unabhängiger Translationssequenzen in menschlichen und viralen Genomen. Science 351, aad4939 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Pestova, TV et al. Molekulare Mechanismen der Translationsinitiierung in Eukaryoten. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 98, 7029–7036 (2001).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hundsdoerfer, P., Thoma, C. & Hentze, MW Der eukaryotische Translationsinitiationsfaktor 4GI und p97 fördern die sequenzgesteuerte Translation des zellulären internen Ribosomeneintritts. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 102, 13421–13426 (2005).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spriggs, KA et al. Kanonische Initiationsfaktoranforderungen der Myc-Familie interner Ribosomeneintrittssegmente. Mol. Zelle. Biol. 29, 1565–1574 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lomakin, IB, Hellen, CU & Pestova, TV Die physikalische Assoziation des eukaryotischen Initiationsfaktors 4G (eIF4G) mit eIF4A verstärkt die Bindung von eIF4G an die interne ribosomale Eintrittsstelle des Enzephalomyokarditis-Virus stark und ist für die interne Initiierung der Translation erforderlich. Mol. Zelle. Biol. 20, 6019–6029 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Imai, S., Kumar, P., Hellen, CUT, D'Souza, VM & Wagner, G. Eine genau vororganisierte IRES-RNA-Struktur ermöglicht die Erfassung von eIF4G zur Initiierung der viralen Translation. Nat. Struktur. Mol. Biol. 23, 859–864 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Clark, AT, Robertson, MEM, Conn, GL & Belsham, GJ Konservierte Nukleotide innerhalb der J-Domäne der internen Ribosomeneintrittsstelle des Enzephalomyokarditis-Virus sind für die Aktivität und die Interaktion mit eIF4G erforderlich. J. Virol. 77, 12441–12449 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kolupaeva, VG, Lomakin, IB, Pestova, TV & Hellen, CUT Die eukaryotischen Initiationsfaktoren 4G und 4A vermitteln Konformationsänderungen stromabwärts des Initiationscodons der internen ribosomalen Eintrittsstelle des Enzephalomyokarditis-Virus. Mol. Zelle. Biol. 23, 687–698 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marcotrigiano, J. et al. Eine konservierte HEAT-Domäne innerhalb von eIF4G steuert den Aufbau der Übersetzungsinitiierungsmaschinerie. Mol. Zelle 7, 193–203 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yanagiya, A. et al. Erfordernis der RNA-Bindung des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 4GI (eIF4GI) von Säugetieren für eine effiziente Interaktion von eIF4E mit der mRNA-Kappe. Mol. Zelle. Biol. 29, 1661–1669 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Berset, C., Zurbriggen, A., Djafarzadeh, S., Altmann, M. & Trachsel, H. RNA-Bindungsaktivität des Translationsinitiationsfaktors eIF4G1 aus Saccharomyces cerevisiae. RNA 9, 871–880 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Friedrich, D., Marintchev, A. & Arthanari, H. Das metaphorische Schweizer Taschenmesser: Die Vielzahl und vielfältigen Rollen von HEAT-Domänen bei der eukaryotischen Translationsinitiierung. Nukleinsäuren Res. 50, 5424–5442 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jones, S., Daley, DT, Luscombe, NM, Berman, HM & Thornton, JM Protein-RNA-Wechselwirkungen: eine Strukturanalyse. Nukleinsäuren Res. 29, 943–954 (2001).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corley, M., Burns, MC & Yeo, GW Wie RNA-bindende Proteine ​​mit RNA interagieren: Moleküle und Mechanismen. Mol. Zelle 78, 9–29 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krüger, DM, Neubacher, S. & Grossmann, TN Protein-RNA-Wechselwirkungen: Strukturmerkmale und Hotspot-Aminosäuren. RNA 24, 1457–1465 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, S., Yamashita, K., Amada, KM & Standley, DM Quantifizierung der Sequenz und Strukturmerkmale von Protein-RNA-Wechselwirkungen. Nukleinsäuren Res. 42, 10086–10098 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yan, J. & Kurgan, L. DRNApred, schnelle sequenzbasierte Methode, die DNA- und RNA-bindende Reste genau vorhersagt und unterscheidet. Nukleinsäuren Res. 45, e84 (2017).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Meissner, A. & Sørensen, OW Die Rolle der Effizienz des Kohärenztransfers beim Design mehrdimensionaler NMR-Experimente vom TROSY-Typ. J. Magn. Resonanz. 139, 439–442 (1999).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Marušič, M., Schlagnitweit, J. & Petzold, K. RNA-Dynamik durch NMR-Spektroskopie. Chembiochem 20, 2685–2710 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Weininger, U., Respondek, M. & Akke, M. Konformationsaustausch aromatischer Seitenketten, gekennzeichnet durch L-optimierte TROSY-selektierte 13C CPMG-Relaxationsdispersion. J. Biomol. NMR 54, 9–14 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luz, Z. & Meiboom, S. Kernspinresonanzstudie der Protolyse von Trimethylammoniumionen in wässriger Lösung – Reihenfolge der Reaktion in Bezug auf das Lösungsmittel. J. Chem. Physik. 39, 366–370 (1963).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Aeschbacher, T. et al. Automatisierte und unterstützte RNA-Resonanzzuordnung mithilfe der NMR-Statistik der chemischen Verschiebung. Nukleinsäuren Res. 41, e172 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Farès, C., Amata, I. & Carlomagno, T. 13C-Nachweis in RNA-Basen: Aufdeckung von Struktur-chemischen Verschiebungsbeziehungen. Marmelade. Chem. Soc. 129, 15814–15823 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Xue, Y. et al. Charakterisierung angeregter RNA-Zustände mittels NMR-Relaxationsdispersion. Methoden Enzymol. 558, 39–73 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Frank, AT, Law, SM & Brooks, CL Ein einfacher und schneller Ansatz zur Vorhersage chemischer Verschiebungen (1)H und (13)C: hin zu durch chemische Verschiebungen gesteuerten Simulationen von RNA. J. Phys. Chem. B 118, 12168–12175 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carver, J. & Richards, R. Eine allgemeine Zwei-Site-Lösung für den chemischen Austausch führte zu einer Abhängigkeit von T2 von der Carr-Purcell-Pulstrennung. J. Magn. Resonanz. 6, 89–105 (1972).

ADS CAS Google Scholar

Mikami, S., Kobayashi, T., Masutani, M., Yokoyama, S. & Imataka, H. Ein in vitro gekoppeltes Transkriptions-/Translationssystem aus menschlichen Zellen, das für die Produktion rekombinanter Proteine ​​optimiert ist. Proteinexpr. Purif. 62, 190–198 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shilling, PJ et al. Verbesserte Designs für pET-Expressionsplasmide steigern die Proteinproduktionsausbeute in Escherichia coli. Komm. Biol. 3, 214 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Motohashi, K. Eine einfache und effiziente nahtlose DNA-Klonierungsmethode unter Verwendung von SLiCE aus Escherichia coli-Laborstämmen und ihre Anwendung auf die ortsgerichtete SLiP-Mutagenese. BMC Biotechnol. 15, 47 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Longhini, AP et al. Chemoenzymatische Synthese ortsspezifisch isotopenmarkierter Nukleotide zur Verwendung bei der NMR-Resonanzzuordnung, Dynamik und Strukturcharakterisierung. Nukleinsäuren Res. 44, e52 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Sajiki, H., Esaki, H., Aoki, F., Maegawa, T. & Hirota, K. Palladium-katalysierte basenselektive HD-Austauschreaktion von Nukleosiden in Deuteriumoxid. Synlett 1385–1388 (2005).

Alvarado, LJ et al. Chemoenzymatische Synthese selektiv 13C/15N-markierter RNA für NMR-Struktur- und Dynamikstudien. Methoden Enzymol. 549, 133–162 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kao, C., Zheng, M. & Rüdisser, S. Eine einfache und effiziente Methode zur Reduzierung der nichttemplatierten Nukleotidaddition am 3'-Terminus von RNAs, die durch T7-RNA-Polymerase transkribiert werden. RNA 5, 1268–1272 (1999).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tan, HV et al. Gewinnung funktioneller DNA-Inserts durch elektroendosmotische Elution während der Gelelektrophorese. Nukleinsäuren Res. 16, 1921–1930 (1988).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mastronarde, DN Automatisierte Elektronenmikroskop-Tomographie mit robuster Vorhersage von Probenbewegungen. J. Struktur. Biol. 152, 36–51 (2005).

Artikel PubMed Google Scholar

Zivanov, J. et al. Neue Werkzeuge zur automatisierten hochauflösenden Kryo-EM-Strukturbestimmung in RELION-3. Elife 7, e42166 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J., Nakane, T. & Scheres, SHW Ein Bayes'scher Ansatz zur strahlinduzierten Bewegungskorrektur in der Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse. IUCrJ 6, 5–17 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2: Anisotrope Korrektur der strahlinduzierten Bewegung für eine verbesserte Kryo-Elektronenmikroskopie. Nat. Methoden 14, 331–332 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, K. Gctf: Echtzeit-CTF-Bestimmung und -Korrektur. J. Struktur. Biol. 193, 1–12 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brito Querido, J. et al. Struktur eines menschlichen 48S-Translationsinitiationskomplexes. Science 369, 1220–1227 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera – ein Visualisierungssystem für explorative Forschung und Analyse. J. Comput. Chem. 25, 1605–1612 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Casañal, A., Lohkamp, ​​B. & Emsley, P. Aktuelle Entwicklungen in Coot für den makromolekularen Modellaufbau von Elektronen-Kryomikroskopie und kristallographischen Daten. Proteinwissenschaft. 29, 1069–1078 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX: ein umfassendes Python-basiertes System zur Lösung makromolekularer Strukturen. Acta Crystallogr. D: Biol. Kristalllogr. 66, 213–221 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF ChimeraX: Strukturvisualisierung für Forscher, Pädagogen und Entwickler. Proteinwissenschaft. 30, 70–82 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Konuma, T., Nagadoi, A., Kurita, J. & Ikegami, T. Analyse von Artefakten, die durch Pulsunvollkommenheiten in CPMG-Pulszügen in NMR-Relaxationsdispersionsexperimenten verursacht werden. Magnetochemistry 4, 33 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) mit der Zuschussnummer JP21ae0121028 (an IS) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch einen Grant-in-Aid for Scientific Research (A) unter der Grant-Nummer 20H00451 (an YF) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Shunsuke Imai, Hiroshi Suzuki.

RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, Tsurumi-ku, Yokohama, 230-0045, Japan

Shunsuke Imai & Ichio Shimada

Labor für Zell- und Strukturphysiologie (CeSPL), Medizinische und Zahnmedizinische Universität Tokio, Bunkyo-ku, Tokio, 113-8510, Japan

Hiroshi Suzuki und Yoshinori Fujiyoshi

Graduate School of Integrated Sciences for Life, Universität Hiroshima, Higashi-Hiroshima, 739-8528, Japan

Ichio Shimada

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SI, HS, YF und IS haben die Forschung entworfen. SI bereitete die RNA-Proben vor und führte ITC- und NMR-Experimente durch. HS bereitete die Proteinproben vor und führte Kryo-EM-Experimente durch. SI, HS, YF und IS analysierten die Daten und verfassten das Manuskript.

Korrespondenz mit Shunsuke Imai oder Ichio Shimada.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Israel Fernandez und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Imai, S., Suzuki, H., Fujiyoshi, Y. et al. Dynamisch regulierte Zwei-Seiten-Interaktion viraler RNA zur Erfassung des Translationsinitiationsfaktors des Wirts. Nat Commun 14, 4977 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40582-6

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Eingegangen: 01. Februar 2023

Angenommen: 27. Juli 2023

Veröffentlicht: 28. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40582-6

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