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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12022 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Extraintestinale pathogene Escherichia coli (ExPEC), die β-Lactamasen mit erweitertem Spektrum (ESBL) produzieren, verursachen aufgrund ihrer Virulenz und ihres Multiresistenzprofils (MDR) schwere Infektionen beim Menschen. Wir haben 144 ExPEC-Stämme (von einem tertiären Krebsinstitut gesammelt) hinsichtlich des antimikrobiellen Empfindlichkeitsspektrums, der ESBL-Varianten, der Virulenzfaktormuster (VF) und der Phylogruppenklassifizierung nach Clermont charakterisiert. Die entwickelten Multiplex-Rekombinase-Polymerase-Amplifikations- und thermophilen Helikase-abhängigen Amplifikations-(tHDA)-Assays für den blaCTX-M-, blaOXA-, blaSHV- und blaTEM-Nachweis wurden mithilfe von PCR-Sequenzierungsergebnissen validiert. Alle ESBL-ExPEC-Isolate trugen blaCTX-M-Gene mit der folgenden Prävalenzhäufigkeit der Varianten: blaCTX-M-15 (50,5 %) > blaCTX-M-55 (17,9 %) > blaCTX-M-27 (16,8 %) > blaCTX-M -14 (14,7 %). Der Multiplex-Rekombinase-Polymerase-Amplifikationstest wies eine Sensitivität und Spezifität von 100 % für blaCTX-M, blaOXA und blaSHV auf, während tHDA eine Sensitivität von 86,89 % und eine Spezifität von 100 % für blaTEM aufwies. Die VF-Gene zeigten die folgende Prävalenzhäufigkeit: traT (67,4 %) > ompT (52,6 %) > iutA (50,5 %) > fimH (47,4 %) > iha (33,7 %) > hlyA (26,3 %) > papC (12,6 %) > cvaC (3,2 %), in ESBL-ExPEC-Isolaten, die zu den Phylogruppen A (28,4 %), B2 (28,4 %) und F (22,1 %) gehörten. Die Verteilung von traT, ompT und hlyA sowie der Phylogruppe B2 war zwischen ESBL-ExPEC- und Nicht-ESBL-ExPEC-Isolaten signifikant unterschiedlich (P < 0,05). Somit tragen diese gerätefreien isothermen Resistenzgenamplifikationstests zu einer wirksamen Behandlung und Kontrolle virulenter ExPEC, insbesondere antimikrobieller Resistenzstämme, bei.

Erweiterte Spektrum-β-Lactamasen (ESBLs) in Enterobacteriaceae werden von der Weltgesundheitsorganisation als die kritischste Ursache für antimikrobielle Resistenzen (AMR) eingestuft, die die Entdeckung neuer Antibiotika erfordern1. Darüber hinaus sind die meisten ESBL-produzierenden Enterobacteriaceae auch multiresistent (MDR), was die Behandlung erschwert2. Extraintestinales pathogenes Escherichia coli (ExPEC) ist ein wichtiger ESBL-produzierender Organismus, der neben dem Darm auch Harnwege, den Blutkreislauf, Meningitis und Wunden infiziert und Sepsis verursacht. ESBL-assoziierte AMR bei ExPEC werden nicht nur im Gesundheitswesen verbreitet, sondern auch bei ambulant erworbenen Infektionen3. Die weltweite Zunahme von ESBL-ExPEC-Stämmen verursacht klinische und wirtschaftliche Verluste in einem ähnlichen Ausmaß wie pathogene E. coli. Anders als bei darmpathogenen E. coli oder kommensalen E. coli ist die Definition des Ursprungs oder des primären Reservoirs von ExPEC die größte Herausforderung bei der Behandlung4. Darüber hinaus ist der Einfluss von AMR- und Virulenzfaktor-Genen (VF) auf die ExPEC-Pathogenität zu einem ernsten globalen Problem geworden. Daher verlassen sich Forscher hauptsächlich auf die ExPEC-Genotypisierung, um den Zusammenhang zwischen AMR-Genen, VF und ihrer phylogenetischen Verteilung zu untersuchen.

Die Verbreitung von ESBL-produzierenden E. coli (ESBL-E coli) bei extraintestinalen Infektionen ist vielfältig und variiert zwischen verschiedenen geografischen Regionen. Die klonale Ausbreitung von E. coli ST131 (im Zusammenhang mit ExPEC-Infektionen, insbesondere Harnwegs- und Blutkreislaufinfektionen) trug zur weltweiten Verbreitung des MDR-Klons5 bei. Unter den ESBL-Genen ist blaCTX-M-15 weit verbreitet, gefolgt von den Genen CTX-M, TEM, SHV, PER, VEB, GES, BES, TLA und OXA6. Die kommensalen E. coli in gesunden Rindern, Schweinen und Hühnern dienen als Reservoir für AMR-Gene7. Die Prävalenz von CTX-M-Genen ist in uropathogenen E. coli (UPEC) höher als in den kommensalen Isolaten gesunder Freiwilliger8. Darüber hinaus können ESBLs, die Enterobacterales (ESBL-Enterobacterales) produzieren, langfristig (> 12 Monate) als Darmmikrobiota kolonisieren9 und die Ausbreitung von ESBL-AMR in einem bestimmten Gesundheitssystem, einschließlich Menschen, Tieren und Umwelt, fördern10. Das weit verbreitete Vorhandensein von ESBL-Genen bei systemischen Infektionen hat auch erhebliche Auswirkungen auf die Therapie- und Mortalitätsergebnisse. Das Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) empfiehlt phänotypische Screening- und Bestätigungstests für die ESBL-Produktion als Teil der regelmäßigen klinischen Behandlung mikrobieller Infektionen11. Allerdings sind die genotypischen Methoden des ESBL-Screenings für das epidemiologische Management vorteilhafter und helfen bei der Bewältigung von Herausforderungen im Zusammenhang mit der phänotypischen Expressionsvarianz12.

Gemäß der molekularen Klassifizierung von Ambler sind ESBLs Serin-β-Lactamasen, die drei signifikante Klasse-A-Gene (blaCTX-M, blaTEM und blaSHV) und ein blaOXA-Gen der Klasse D umfassen. Kürzlich wurden verschiedene neu entdeckte isotherme Nukleinsäureamplifikationstechniken, die keine teuren Thermozyklusmaschinen erfordern, in großem Umfang für den schnellen und einfachen Nachweis von AMR-Genen eingesetzt13. Im Jahr 2021 wurde ein 10-minütiger Lateral-Flow-Assay mit bloßem Auge und schneller Multiplex-Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) entwickelt, um die drei häufigen ESBL-Gene (blaCTX-M, blaOXA und blaSHV) nachzuweisen14. Allerdings erwies sich die Verwendung eines manipulierten Rekombinase-Enzyms aus E. coli K12- oder BL21-Stämmen (die ihr eigenes blaTEM-Gen tragen) als großer Rückschlag; Die Verwendung dieser RPA-Kits war mit Kreuzreaktivität und falsch positiven Ergebnissen verbunden15. Helicase-abhängige Amplifikationstechniken wie RPA nutzen ein Primerpaar, um ein spezifisches DNA/RNA-Ziel bei einer festgelegten Temperatur zu amplifizieren. Um doppelsträngige DNA abzuwickeln und ein neues Amplikon zu erzeugen, verwendet das RPA-Kit (TwistDx) Rekombinase und DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität (Sau-Polymerase), während das IsoAmp® II Universal tHDA-Kit (New England Biolabs) eine thermostabile Helikase Tte verwendet -UvrD aus Thermoanaerobacter tengcongenesis und Bacillus stearothermophilus DNA-Polymerase (Bst-DNA-Polymerase)16. Die optimalen Amplifikationsbedingungen für RPA und tHDA sind 37–42 °C für 20–40 Minuten bzw. 60–65 °C für 90–120 Minuten17. Sowohl RPA als auch tHDA sind tragbare Assays zum Nachweis von Nukleinsäuren, die sich ideal für den Einsatz am Point-of-Care oder in ressourcenbeschränkten Feldumgebungen eignen13.

Die ExPEC-Pathogenität wird durch mehrere VF-Gene mit weitreichenden Funktionen beeinflusst, die von der bakteriellen Besiedlung bis zur Virulenz reichen18. Darüber hinaus werden die meisten VF-Gene durch Plasmide, Pathogenitätsinseln (PAI)18,19 oder andere mobile genetische Elemente18 kodiert, die horizontal auf andere pathogene und nicht-pathogene Bakterien übertragen werden. E. coli wird mithilfe der einfacheren Quadruplex-PCR (die weniger komplex und schneller ist als Multilocus-Sequenztypisierungs- oder Ribotypisierungsmethoden) in acht phylogenetische Gruppen (A, B1, B2, C, D, E, F und Clade I) eingeteilt20 . Die Assoziation von ESBLs, VF-Genen und Phylogruppen wurde sowohl in ExPEC als auch in kommensalen E. coli untersucht. Milenkov et al. fanden heraus, dass blaCTX-M-15 das am häufigsten vorkommende ESBL-Gen in E. coli-Proben war, die von gesunden schwangeren Frauen aus Madagaskar isoliert wurden. Darüber hinaus gehörten 90 % dieser Isolate zu den phylogenetischen Gruppen A, B1 und C (die mit Kommensalismus assoziiert sind und einige VF-Gene tragen, die an Adhäsion und Eisenaufnahme beteiligt sind). Während 10 % dieser Isolate zu den extraintestinal virulenten phylogenetischen Gruppen B2, D und F21 gehörten. Bei Reisenden, die tropische Gebiete besuchten, wurde 3 oder mehr Monate nach ihrer Rückkehr eine anhaltende Langzeitübertragung (durchschnittlich 3,5 Monate) von ESBL-Enterobacterales (die zur extraintestinalen Virulenz-assoziierten Phylogruppe B2/D/F gehörten) beobachtet. Dagegen blieben die kommensalen assoziierten Phylogruppen A/B1/E für kürzere Transportdauern (ca. 0,5 Monate) bestehen21. Die Phylogruppe B2 von uropathogenen E. coli (UPEC) zeigte maximale AMR und trug sechs VFs22. ESBL-ExPECs, die VF-Gene tragen und aus Blutkreislaufinfektionen isoliert wurden, zeigten die folgende Reihenfolge der Phylogruppen-Vorherrschaft: B2 (45,8 %) > B1 (18,8 %) > E (14,6 %). Die ESBL-Gene blaCTX-M-15 und VF traT waren die vorherrschendsten23. E. coli, nach Streptokokken der Gruppe B der häufigste Erreger, der bei Frühinfektionen eine Meningitis bei Neugeborenen verursacht, gehörte zur extraintestinalen Phylogruppe B2; > 70 % dieses pathogenen E. coli-Stamms tragen die Gene kpsII, K1, neuC, iucC, sitA und vat. Im Gegensatz dazu gehörten von gesunden Personen gewonnene E. coli zu den Gruppen A und D; Sie tragen < 27 % der VF-Gene24,25.

Unser Ziel war die Entwicklung isothermer Amplifikationstests zur Charakterisierung von ESBL-Genen (blaCTX-M, blaOXA, blaSHV und blaTEM) in ESBL-ExPEC-Stämmen. Die Sensitivität und Spezifität dieser Tests wurden mithilfe der Nukleotidsequenzierung validiert. Diese einfachen isothermen Plattformen können in Umgebungen mit geringen Ressourcen zur Überwachung von ESBL in allen klinischen Proben eingerichtet werden. Darüber hinaus haben wir die in den klinischen ESBL-ExPEC-Isolaten gefundenen VF-Gene (traT, ompT, iutA, fimH, iha, hlyA, papC und cvaC) charakterisiert und phylogenetisch analysiert. Die Identifizierung von Zusammenhängen zwischen ESBL-Genen, VF-Genen und ESBL-ExPEC-Phylogruppen ist wichtig für eine verbesserte globale AMR-Überwachung, gezielte Antibiotikabehandlung und Infektionskontrolle.

Von den 144 ExPEC, die aus verschiedenen extraintestinalen Proben, einschließlich Blut, Urin, Eiter, Körperflüssigkeit und Sputum, isoliert wurden, wurden 95 ESBL- und 49 Nicht-ESBL-ExPEC-Stämme durch die in der CLSI-Richtlinie11 angegebene Kombinationsscheibenmethode identifiziert. Alle 95 ESBL-produzierenden E. coli wurden einer Genotypisierung unterzogen. Wir fanden blaCTX-M-Gene (n = 95) einzeln oder in Kombination mit den Genen blaTEM (n = 40), blaOXA (n = 29) und blaSHV (n = 2) (Ergänzungstabelle S1). Darüber hinaus enthielten 21 von 49 phänotypisch gescreenten nicht ESBL-produzierenden E. coli das blaTEM-1-Gen, während im Rest keines der Gene blaTEM, blaOXA, blaSHV und blaTEM beobachtet wurde. Die PCR-Sequenzierungsergebnisse der CTX-M-Varianten ergaben die folgende Prävalenzreihenfolge: blaCTX-M-15 (50,5 %) > blaCTX-M-55 (17,9 %) > blaCTX-M-27 (16,8 %) > blaCTX-M -14 (14,7 %). Das blaSHV wurde nur in 2 Isolaten gefunden. Das Antibiotika-Empfindlichkeitsmuster der häufigsten ESBL-ExPEC-Varianten (CTX-M-15-, CTX-M-27-, CTX-M-14- und CTX-M-55-Typen) zeigte eine 100-prozentige Resistenz gegen Cefotaxim und Cefdinir, wie in der Tabelle beschrieben 1. Die folgende Reihenfolge (hoch–niedrig) wurde bei der MDR gegenüber Ceftriaxon, Cefepim, Ciprofloxacin, Ceftazidim, Levofloxacin und Gentamycin beobachtet: blaCTX-M-15-Isolate > blaCTX-M-55 > blaCTX-M-27-Isolate.

Die optimale Konzentration der Primer blaCTX-M, blaOXA und blaSHV, die in der Multiplex-RPA-Reaktion erforderlich sind, betrug 0,2 µM CTX-M, 0,1 µM OXA bzw. 0,1 µM SHV (Abb. 1A). Alle Produkte wurden bei 37–39 °C (Abb. 1B) nach 25–30 Minuten amplifiziert (Abb. 1C). Die DNA-Matrizenkonzentration im Bereich von 12,5–25 ng zeigte die offensichtlichen Banden aller drei Amplifikate (Abb. 1D). Das blaSHV-Amplikon fehlte bei 41 °C und einer Inkubationsdauer von < 25 Minuten. Schließlich wurde die folgende Multiplex-RPA-Reaktionsbedingung als optimal gewählt: 37 °C für 25 Minuten unter Verwendung von 25 ng Template-DNA.

Optimierung des RPA-Assays. Agarosegelelektrophorese zeigt die blaCTX-M-, blaOXA- und blaSHV-Amplikons (A), wenn 0,2 µM CTX-M, 0,1 µM OXA, 0,1 µM SHV und 0,2 µM CTX-M, 0,05 µM OXA und 0,05 µM SHV verwendet wurden; (B) bei 37–41 °C; (C) bei 10–30-minütiger Inkubation; und (D) bei unterschiedlichen DNA-Template-Konzentrationen (1,5–25 ng) [M, 100 bp Marker; C+, positive DNA-Kontrolle; C−, keine Vorlagenkontrolle].

Anstelle von RPA wurde tHDA eingesetzt, um 111 bp von blaTEM zu amplifizieren. Das blaTEM-Amplikon wurde bei 65–67 °C (Abb. 2A) und einer Inkubationszeit von 30–90 Minuten beobachtet (Abb. 2B). Die optimalen DNA-Templat- und Primerkonzentrationen betrugen 50–100 ng (Abb. 2C) bzw. 0,025–0,05 µM (Abb. 2D). Die folgende tHDA-Bedingung wurde als optimal ausgewählt: 65 °C für 30 Minuten unter Verwendung von 50 ng Template-DNA und 0,025 µM Primern.

Optimierung des tHDA-Assays. Die Agarosegelelektrophorese zeigte die blaTEM-Amplifikate (A) bei 59–67 °C; (B) bei 15–90 Min.; (C) bei verschiedenen DNA-Template-Konzentrationen (0,05–100 ng); und (D) bei unterschiedlichen Primerkonzentrationen (0,025–0,075 µM) [M, 100 bp Marker; C+, positive DNA-Kontrolle; C−, keine Vorlagenkontrolle].

Die DNA-Matrizen wurden aus dem klinischen E. coli-Stamm ESBL120 mit blaCTX-M, dem Stamm KP125 mit blaOXA, dem Stamm EC137 mit blaTEM und K. pneumoniae ATCC 700.603 mit blaSHV isoliert. Die LOD von Multiplex-RPA-Assays für die Gene blaCTX-M, blaOXA und blaSHV (Abb. 3A–C) betrug 5 ng, 0,5 ng bzw. 0,5 ng. Die Empfindlichkeit war 10–100-mal höher als die des tHDA-Assays für blaTEM (LOD von 50 ng) (Abb. 3D).

(A–C) LODs für den Nachweis von blaCTX-M, blaOXA und blaSHV mittels RPA-Assay; (D) LODs für die blaTEM-Erkennung durch tHDA; (E) Spezifität des RPA-Assays für die Gene blaCTX-M, blaOXA und blaSHV; und (F) Spezifität des tHDA-Assays für das blaTEM-Gen [M, 100 bp Marker; C+, positive DNA-Kontrolle; C−, keine Vorlagenkontrolle].

Amplikons fehlten (Abb. 3E und F) in RPA- und tHDA-Assays der DNA der folgenden Organismen: E. coli ATCC 25.922, Proteus mirabilis ATCC 25.933, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27.853, Acinetobacter baumannii ATCC 19.606, Staphylococcus aureus ATCC 25.923 und Enterococ cus faecalis ATCC 29.212. Aus der DNA von K. pneumoniae ATCC 700.603, die natürlicherweise blaSHV enthält, wurde ein 214 bp großes Amplifikat hergestellt.

Insgesamt 95 ESBL-ExPEC und 49 Nicht-ESBL-ExPEC wurden Multiplex-RPA- und tHDA-Assays unterzogen. Die Ergebnisse der blaCTX-M-, blaOXA- und blaSHV-Gene aus Multiplex-RPA-Assays stimmten mit den Ergebnissen der PCR-Sequenzierung überein und zeigten eine Sensitivität von 100 % (95 %-KI = 96,19–100 %, 88,06–100 %, 15,81–100 %). , 100 % Spezifität, positiver Vorhersagewert (PPV) und negativer Vorhersagewert (NPV) (95 %-KI: 92,75–100 %, 96,84–100 % bzw. 97,44–100 %) (Tabelle 2). Während der tHDA-Assay acht falsch-negative Proben des blaTEM-Gens ergab, ergaben sich 86,89 % (95 %-KI = 93,28–100), 100 % (95 %-KI = 83,41–96,13 %), 100 % (95 %-KI = 28,93–45,42 %). und 91,21 % (95 %-KI = 77,37–92,78 %) Sensitivität, Spezifität, PPV bzw. NPV. Die Identifizierungsgenauigkeit für die Gene blaCTX-M, blaOXA und blaSHV betrug 100 % und das Gen blaTEM betrug 94,44 %.

In den 95 klinischen ESBL-ExPEC-Isolaten zeigten die VF-Gene die folgende Häufigkeitsreihenfolge: traT (67,4 %) > ompT (52,6 %) > iutA (50,5 %) > fimH (47,4 %) > iha (33,7 %) > hlyA (26,3 %) > papC (12,6 %) > cvaC (3,2 %), jeweils (Tabelle 3). Alle VF-Gene waren auf CTX-M-Varianten verteilt, mit Ausnahme von papC und cvaC, die in der CTX-M-27-Variante nicht gefunden wurden. Das traT-Gen wurde häufig in CTX-M-15 (75 %), CTX-M-14 (64,3 %) und CTX-M-55 (76,5 %) gefunden. Während das iha-Gen in CTX-M-27 vorherrschte (70,6 %). Zu den häufigsten Phylogruppen unter ESBL-ExPEC-Stämmen gehörten: A (28,4 %), B2 (28,4 %), F (22,1 %). Die CTX-M-14, 15 und 55 (35,7 %, 29,2 % und 47,1 %) waren in der Phylogruppe A vorherrschend, während die meisten CTX-M-27 zur Phylogruppe B2 gehörten (70,6 %). In den seltenen Phylogruppen B1 und E wurden nur die Varianten CTX-M-15 und CTX-M-55 gefunden.

ESBL-ExPEC- und Nicht-ESBL-ExPEC-Isolate trugen überwiegend traT bzw. ompT (Tabelle 4). Überraschenderweise fehlte cvcC in unseren Nicht-ESBL-Isolaten. Die Assoziation von traT, ompT und hlyA war zwischen den ESBL-ExPEC- und Nicht-ESBL-ExPEC-Isolaten signifikant unterschiedlich (P < 0,05). Die Phylogruppe dominierte wie folgt: Phylogruppe B2 (35,4 %) > A (23,6 %) > F (19,4 %). ESBL-ExPEC wurden von den Phylogruppen A und B2 dominiert, während Nicht-ESBL-ExPEC von der Phylogruppe B2 dominiert wurden. Nur die Phylogruppe B2 unterschied sich signifikant zwischen ESBL- und Nicht-ESBL-Gruppen (P < 0,05). Phylogroup Clades I fehlte in allen klinischen Isolaten. Die Varianzanalyse mittels Friedman-Test ergab einen signifikanten Unterschied in der VF-Genverteilung (P = 0,000). Drei VF-Gene (hlyA, iha und ompT) waren unterschiedlich über die Phylogruppen verteilt (Tabelle 5). Die paarweise Analyse der Phylogruppe zeigte, dass hlyA mit der Phylogruppe A und iha mit den Phylogruppen F, A und B2 assoziiert war (P < 0,05). Während ompT mit den Phylogruppen B2 und F assoziiert war (P < 0,05).

ExPEC ist eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität sowohl bei im Krankenhaus als auch bei ambulant erworbenen Infektionen. Abgesehen von epidemiologischen Faktoren dürfte der Erwerb von VFs und AMR zur globalen Pandemie der ExPEC-Linien beitragen4,26. Darüber hinaus kommt es zwischen den Arten leicht zu einem plasmidvermittelten horizontalen Transfer von ESBL-Genen, der zu weitverbreiteten Infektionen führt6. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass VFs gastrointestinalen Krankheitserregern dabei helfen, die kommensale Mikrobiota zu verdrängen und die Immunität des Wirts zu beeinträchtigen, indem sie Kolonisierung, Resistenz und Invasion induzieren27.

ESBL-Enterobacteriaceae, insbesondere E. coli, war eines der häufigsten Isolate in Blutinfektionsproben, die in einem pädiatrischen Onkologiezentrum entnommen wurden28. Die MDR-E. coli von Patienten mit fieberhaftem neutropenischem Krebs zeigten eine hohe Resistenz gegen Ampicillin, Cefepim, Ceftriaxon und Cephradin29. Hier trugen alle aus Krebspatienten isolierten ESBL-ExPEC blaCTX-M und zeigten die folgende Dominanz: blaCTX-M1-Gruppe (68,4 %; 50,5 % blaCTX-M-15 und 17,9 % blaCTX-M-55) > blaCTX-M9-Gruppe ( 31,5 %; 16,8 % blaCTX-M-27 und 14,7 % blaCTX-M-14). MDR wurde in allen CTX-M-Varianten beobachtet. Sie waren resistent gegen Ceftriaxon, Cefepim, Ciprofloxacin, Ceftazidim, Levofloxacin und Gentamycin. In ähnlicher Weise trugen ESBL-ExPECs (aus tertiären Krankenhäusern in Thailand) überwiegend blaCTX-M1 (71,23 %) und blaCTX-M9 (38,95 %)30. Der weltweit pathogene Stamm E. coli ST 131 enthält blaCTX-M-15 (67,6 %), blaCTX-M-27 (20,6 %) und blaCTX-M-14 (11,8 %)31. Weltweit wird häufig über das blaCTX-M-15-ESBL-Gen berichtet, insbesondere bei Blutkreislauf- und Harnwegsinfektionen23,32,33,34. Das blaCTX-M-55 ist in den meisten E. coli vorhanden, die aus Schweine- und Stuhlproben isoliert wurden14,35.

Es gibt mehrere Tests zur Genotypisierung von ESBL-Genen: (1) Kanokudom et al.14 entwickelten einen schnellen Multiplex-RPA-Test mit bloßem Auge zum Nachweis von blaCTX-M, blaOXA und blaSHV in Schweine-E.-coli-Isolaten. Amplikons wurden auf einem einzelsträngigen Tag-Hybridisierungs-Chromatographie-Printed-Array-Streifen (STH-PAS, ein kommerzieller Lateral-Flow-Assay-Streifen) sichtbar gemacht; (2) Higgins et al.36 entwickelten einen tragbaren Loop-Primer-Endonuklease-Spaltungs-Loop-vermittelten isothermen Amplifikationstest (Loop-Primer-Endonuklease-Spaltungs-LAMP) zum Nachweis von blaCTX-M-1 und blaCTX-M-15 im Schweinekot E. coli-Isolate; und (3) Wang et al. entwickelte einen sondenbasierten Echtzeit-PCR-Assay zum Nachweis von blaCTX-M, blaTEM und blaSHV in E. coli-Isolaten von Masthühnern37.

Hier haben wir die folgenden isothermen Tests zum Nachweis häufiger ESBL-Gene entwickelt: (1) ein Multiplex-RPA-Test zum Nachweis der Gene blaCTX-M, blaOXA und blaSHV; und (2) ein tHDA-Assay zum Nachweis des blaTEM-Gens. Die Amplikons wurden durch die Agarosegelelektrophorese-Methode sichtbar gemacht, eine kostengünstige und weit verbreitete Technik im allgemeinen Molekularlabor. Diese einfachen isothermen Plattformen für die Nukleinsäureamplifikation nutzen nur ein Primerpaar (wie PCR) und die allgemein verfügbaren Heizgeräte. Darüber hinaus ist das RPA-Kit (TwistAmp Basic Kit) im Vergleich zu anderen isothermen Plattformen ein äußerst stabiles lyophilisiertes Reagenz mit langer Haltbarkeit38. Die lyophilisierten Pellets im RPA-Kit sind bei Lagerung bei Temperaturen unter −15 °C oder bei 2–8 °C mindestens ein Jahr und bei Raumtemperatur (22–28 °C) bis zu 6 Monate haltbar39. Allerdings ist das RPA-Kit etwas teurer (~ 4,3 USD) als andere Amplifikationstests wie PCR und LAMP (abgelaufene Patente)38. Darüber hinaus soll das RPA-Patent im Jahr 202340 auslaufen, was den Weg für die Entwicklung einer neuen kostengünstigen internen RPA-Formel frei macht, die groß angelegte Anwendungen ermöglichen wird.

Die Nukleotidzusammensetzungen und die Länge der Primer beeinflussen die optimale Annealing-Temperatur und Inkubationszeit in Multiplex-RPA-Reaktionen. Hier ergaben hohe Temperaturen (die zu einer schlechten Primerbindung führten) oder kurze Inkubationszeiten keine blaSHV-Amplifikate, wahrscheinlich weil die blaSHV-Primer niedrigere GC-Gehalte und kürzere Längen als die Primer blaCTX-M und blaOXA aufweisen. Hohe Primerkonzentrationen erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Primer-Dimeren und unspezifischen Amplikons in Multiplex-RPA-Reaktionen, während niedrige Konzentrationen zu geringen Ausbeuten führen können. Daher sind ein gutes Primer-Design und eine umfassende Optimierung für eine effektive multiplexierte isotherme Amplifikation von entscheidender Bedeutung41. Der LOD unseres Multiplex-RPA-Gelelektrophorese-Assays beim Nachweis der Gene blaCTX-M, blaOXA und blaSHV war etwas niedriger als der des vorherigen Multiplex-RPA-Lateral-Flow-Assays (LFA)14. RPA-Amplikons müssen vor dem Laden auf das Agarosegel gereinigt werden, um Proteinverunreinigungen zu entfernen42. Dieser RPA-Reinigungsschritt nach der Amplifikation führt zum Amplikonverlust. Darüber hinaus hängt die Nachweisempfindlichkeit der Agarosegelelektrophorese von der Wirksamkeit verschiedener Schritte (Vorbeladung, Vorgießen und Nachfärben) ab43. Daher ist die RPA-Reinigung nach der Amplifikation ein großer Nachteil für die Gelelektrophorese-Detektion44. Es gibt verschiedene Methoden zur Reinigung von RPA-Produkten, darunter Hitzedenaturierung (65 °C oder 95 °C für 10 Minuten), Natriumdodecylsulfat-Behandlung, Proteinase-K-Verdauung, Proteinsedimentation mittels Hochgeschwindigkeitszentrifugation und Reinigung mit kommerziellen DNA-Reinigungskits44. Obwohl die Agarose-Gelelektrophorese eine gängige Methode zur Visualisierung von Amplifikationsprodukten ist, ist sie aufgrund der Gelvorbereitung, Elektrophorese, Gelfärbung und Bildgebungsschritte zeitaufwändig. Diese Einschränkungen können in Zukunft umgangen werden – durch den Einsatz verschiedener interner Nachweismethoden (die Brückenflockung, SYBR Green I oder Lateral-Flow-Assays verwenden) – um ein kostengünstiges, einfaches, gerätefreies, schnelles und nacktes Verfahren zu entwickeln. Augentest zum Nachweis der gewünschten Gene39,44.

Die Bestimmung der LOD des tHDA-Assays für blaTEM erforderte das 10- bis 100-fache der Template-Konzentration, die in RPA-Assays für die Gene blaCTX-M, blaOXA und blaSHV verwendet wird. Die Hochtemperatur-tHDA-Betriebsbedingungen (60–65 °C) können die Primerbindungseffizienz beeinträchtigen; Die Spezifität könnte jedoch höher sein als bei der mesophilen isothermen Amplifikation38. Darüber hinaus verwendeten wir im Vergleich zu RPA und PCR niedrigere Primerkonzentrationen (0,1–1 μM gegenüber 75–100 nM) für den tHDA-Assay. Das tHDA-Amplikon ist aufgrund der Helikase-Prozessivität, die die Multiplexkapazität begrenzt, im Allgemeinen < 150 Nukleotide lang41,45. Unser Multiplex-RPA-Assay zeigte 100 % Sensitivität und Spezifität für die Gene blaCTX-M, blaOXA und blaSHV. Allerdings hatte tHDA eine Sensitivität von 86,89 % und eine Spezifität von 100 % für blaTEM. Der höhere LOD und die niedrigeren Primerkonzentrationen könnten dazu geführt haben, dass der tHDA-Assay im Vergleich zum RPA-Assay eine geringere Empfindlichkeit aufwies. Bei Proben mit geringer Menge und Qualität der DNA (alte/degradierte DNA) können falsch-negative Ergebnisse auftreten.

ExPEC-Stämme weisen im Vergleich zu kommensalen E. coli-Stämmen eine komplexe phylogenetische Struktur und vielfältige VFs auf4. ExPEC-Stämme wie uropathogene E. coli (UPEC), neonatale Meningitis-E. coli (NMEC), Sepsis-assoziierte E. coli (SEPEC) und aviäre pathogene E. coli (APEC) weisen mehrere VFs auf. ExPEC-VFs – wie Adhäsine, Toxine und Eisenaufnahme, Lipopolysaccharide, Kapseln und Invasine – erleichtern ihre Kolonisierung und systemische Infektion. UPEC verursacht überwiegend Harnwegsinfektionen und sekundäre Bakteriämie18. Hier waren drei VF-Gene (traT, ompT und hlyA) signifikant mit ESBL-ExPEC-Stämmen assoziiert. traT war die am weitesten verbreitete Variante und kam in den Varianten CTX-M-14, 15 und 27 vor. Weitere vorherrschende VF-Gene waren Aerobactin-Akquisition (iutA) und Adhäsine (fimH und iha). Während einige wenige cvaC nur in unseren klinischen ESBL-ExPEC-Isolaten vorkamen. Das Serumresistenzgen traT, das den klassischen Weg der Komplementaktivität hemmt, ist in allen Pathotypen vorhanden und kommt bei UPEC häufiger vor46,47,48. Das mit UPEC assoziierte Außenmembranprotein (ompT) ermöglicht das intrazelluläre Überleben und die Umgehung der Wirtsabwehr. Hämolysin A (hlyA) ist ein Membranlysetoxin, das in UPEC-Stämmen vorkommt. Es wurde festgestellt, dass das afimbriale Adhäsin (afa) mit der Bakteriämie-Mortalität assoziiert ist23.

Nur die Phylogruppe B2 unterschied sich signifikant zwischen ESBL-ExPEC und Nicht-ESBL-ExPEC. In ähnlicher Weise trugen die Cephalosporin-resistenten E. coli-Isolate mit erweitertem Spektrum, die zur Phylogruppe B2 gehören, ESBL- und/oder Plasmid-vermittelte AmpC-Gene; blaCTX-M-15, blaCTX-M-14 und blaCTX-M-55 waren am häufigsten49. Die Phylogruppe A und F sind Kommensal- bzw. Vogelstämme50. Sie sind die zweit- und dritthäufigste Phylogruppe in unseren E. coli-Isolaten. Darüber hinaus waren nur drei VF-Gene (ompT, iha und hlyA) unterschiedlich über die Phylogruppen verteilt, insbesondere in B2, F und A. Die Phylogruppe B2 war in klinischen Isolaten (von vielen systemischen Infektionen) am häufigsten und trug eine größere Anzahl der VFs als andere Phylogruppen4. Obwohl die Phylogruppe F weniger virulent als B2 war, ist ihre klinische Bedeutung bei der Vermittlung von AMR bei ExPEC nachgewiesen49,51,52.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die meisten ESBL-ExPECs ein MDR-Muster der Phylogruppe B2 besaßen und mehr VF-Gene trugen. Es wurde festgestellt, dass traT, ompT und hlyA mit ESBL-ExPEC-Stämmen assoziiert sind. Die Beziehung zwischen VF-Genen wurde erstmals über Phylogruppen hinweg mit unterschiedlichem ompT, iha und hlyA nachgewiesen. Die Pathotypen von E. coli sollten in Zukunft charakterisiert werden. Die Identifizierung und Charakterisierung von AMR- und VF-Genen sowie deren Pathotypen und die phylogenetische Analyse können zur Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung von E. coli-vermittelten systemischen Infektionen beitragen. Darüber hinaus sind unsere hier vorgestellten Multiplex-RPA- und tHDA-Assays einfach, schnell und zuverlässig beim Nachweis der häufigsten ESBL-Gene. Diese Tests sind nützlich für die Strategieplanung einer gezielten Therapie in Umgebungen mit geringen Ressourcen (unter Verwendung herkömmlicher Heizgeräte) und für die epidemiologische Kontrolle.

Zwischen Februar 2017 und September 2018 wurden in einem tertiären Krebsinstitut in Bangkok (Thailand) insgesamt 144 klinische E. coli-Isolate aus verschiedenen Proben, darunter Blut, Urin, Eiter, Körperflüssigkeit und Sputum, gesammelt. Alle Isolate wurden in Magermilch konserviert bis zur Verwendung bei − 80 °C aufbewahren.

Die hier verwendete Stichprobengröße wurde mithilfe der Buderer-Methode53 berechnet, die dabei hilft, die Sensitivität und Spezifität diagnostischer Tests mit einem Konfidenzintervall von 95 % zu bewerten. Die Studie wurde von der Ethikkommission des National Cancer Institute, Thailand, genehmigt (Zertifikatsnummer 020/2562).

Fünfundneunzig ESBL-ExPEC- und neunundvierzig Nicht-ESBL-ExPEC-Isolate wurden nacheinander und nicht doppelt aus klinischen Proben durch phänotypisches ESBL-Screening ausgewählt. Ihre antimikrobielle Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Antibiotika – darunter Amikacin (30 µg), Gentamicin (10 µg), Ampicillin (10 µg), Amoxicillin/Clavulansäure (20/10 µg), Ceftazidim (30 µg), Cefotaxim (30 µg), Cefdinir (5 µg), Cefepim (30 µg), Ciprofloxacin (5 µg), Ceftriaxon (30 µg), Doripenem (10 µg), Ertapenem (10 µg), Imipenem (10 µg), Meropenem (10 µg), Levofloxacin ( 5 µg) und Piperacillin/Tazobactam (1,25/23,75 µg) – wurde mithilfe der Scheibendiffusionsmethode bestimmt. Die Bestätigungstests des ESBL wurden mit der Kombinationsscheibenmethode gemäß den CLSI-Richtlinien11 durchgeführt. Es wurde davon ausgegangen, dass ESBLs erzeugt wurden, wenn die Größe einer der Hemmzonen von Cefotaxim/Clavulansäure (30/10 µg) oder Ceftazidim/Clavulansäure (30/10 µg) ≥ 5 mm im Vergleich zu der von Cefotaxim (30 µg) oder Ceftazidim war (30 µg).

DNA wurde aus reinen E. coli-Kolonien isoliert, die auf MacConkey-Agar durch Kochmethode kultiviert wurden. Kurz gesagt, Bakterienisolate wurden in 400 µL Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer) suspendiert, mit einem Vortex gemischt und 10 Minuten lang bei 95 °C gekocht. Der Überstand wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 12.000 U/min abgetrennt. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M NaOAc, pH 5,2, und 2–3 Volumen gekühltem absolutem Ethanol ausgefällt und 15 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert. Die Bakterien-DNA wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 µL TE-Puffer gelöst. Die DNA wurde zur anschließenden Amplifikation bei –20 ° C gelagert.

Alle klinischen E. coli-Isolate wurden auf das Vorhandensein von ESBL-Genen (blaCTX-M, blaOXA, blaSHV und blaTEM) untersucht. Darüber hinaus wurden die Gene sequenziert, um die Varianten zu identifizieren. Die Primersequenzen und Amplikongrößen jedes ESBL-Gens sind in der Ergänzungstabelle S2 beschrieben. Die PCR-Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 25 µL durchgeführt, bestehend aus 50 ng DNA, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,4 µM jedes Primers, 1 × Standard-Taq-Reaktionspuffer und 1,25 U Taq-Polymerase (New England Biolabs, VEREINIGTES KÖNIGREICH). Die Amplifikation jedes ESBL-Gens wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt54,55,56,57. Die Positivkontrolle von blaTEM, blaCTX-M, blaOXA und blaSHV wurde von E. coli EC137 bzw. K.pneumoniae KP125 abgeleitet (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Visanu Thamlikitkul, Fakultät für Medizin Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok, Thailand). Alle PCR-Produkte wurden mittels 2 %iger Agarosegelelektrophorese untersucht. Die amplifizierten Fragmente wurden sequenziert (Bioneer Corporation, Südkorea) und mithilfe des BLASTn-Programms (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) und Clustal Omega (https://www.ebi) mit der GenBank-Datenbank abgeglichen. ac.uk/Tools/msa/ustalo/).

Die zuvor beschriebenen RPA-Primer für die Gene blaCTX-M, blaOXA und blaSHV wurden verwendet (Ergänzungstabelle S3). Die Multiplex-RPA-Reaktion wurde mit dem TwistAmp Basic-Reaktionskit (TwistDx, UK) durchgeführt. Der RPA-Mastermix enthielt 0,2 µM blaCTX-M-Primer, jeweils 0,1 µM blaOXA- und blaSHV-Primer, 29,5 µL Rehydrierungspuffer, 50 ng DNA-Matrize und steriles destilliertes Wasser, das hinzugefügt wurde, um ein Endvolumen von 47,5 µL zu erhalten. Die Reaktion wurde mit dem Vortex gemischt, dann in ein gefriergetrocknetes Röhrchen überführt und schließlich mit 2,5 µL 280 mM MgOAc gemischt. Die Reaktion wurde 25 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Um die optimalen Bedingungen der Multiplex-RPA-Reaktionen für blaCTX-M, blaOXA und blaSHV zu untersuchen, wurden die folgenden Bedingungen ausprobiert: (a) zwei Sätze von CTX-M-, OXA- und SHV-Primerkonzentrationen – 0,2, 0,1, 0,1 und 0,2 , 0,05, 0,05 µM; (b) drei Reaktionstemperaturen – 37 °C, 39 °C und 41 °C; und (c) fünf Inkubationsdauern – 10, 15, 20, 25 und 30 Minuten. Die RPA-Amplikons wurden mit einem GeneJet PCR-Reinigungskit (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) gereinigt und mittels 2 % Agarosegelelektrophorese nachgewiesen.

Das blaTEM-Gen von E. coli (Zugangsnummer MG515250.1) wurde für das Primerdesign mit dem Programm Primer3plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi) verwendet. Die Sequenzen waren wie folgt: Vorwärtsprimer, 5'-TGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTAC-3'; Rückwärtsprimer, 5′-CCCTACGATCAAGGCGAGTTACATGAT-3′. Die tHDA-Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 50 µL unter Verwendung des IsoAmp® II Universal tHDA Kit (New England Biolabs, Inc., USA) durchgeführt. Der Reaktionsmischer enthielt 1X Annealing-Puffer II, 4 mM MgSO4, 40 mM NaCl, 3,5 µL IsoAmp® dNTP-Lösung, 0,075 µM jedes Primers und 3,5 µL IsoAmp® Enzyme Mix. Die Reaktion wurde mit Mineralöl überschichtet und 75 Minuten lang bei 67 °C inkubiert. Die tHDA-Bedingung wurde durch Variation der Primerkonzentration (0,025, 0,050 und 0,075 µM), der Temperatur (63 °C, 65 °C, 67 °C, 69 °C, 71 °C) und der Inkubationszeit (30, 45, 60) optimiert , 75 und 90 Minuten). Das tHDA-Amplikon von 111 bp wurde mittels 2 %iger Agarosegelelektrophorese nachgewiesen.

Die Matrizen-DNA von E. coli EC120, K. pneumoniae KP125, K. pneumoniae ATCC 700.603 und E. coli EC137, die die Gene blaCTX-M, blaOXA, blaSHV bzw. blaTEM beherbergen, wurden auf 100, 50, 5, 0,5 verdünnt. Konzentrationen von 0,05 ng/µL. Der LOD wurde als die niedrigste DNA-Konzentration bewertet, die für die Amplikonproduktion unter Verwendung der (in dieser Studie) optimierten Multiplex-RPA- und tHDA-Assays erforderlich ist. Die Spezifität wurde auch anhand von DNA bewertet, die aus E. coli ATCC 25.922, K. pneumoniae ATCC 700.603, Proteus mirabilis ATCC 25.933, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27.853, Acinetobacter baumannii ATCC 19.606, Staphylococcus aureus ATCC 25.923 und Enterococcus faecalis AT isoliert wurde CC 29.212.

Alle 144 klinischen Isolate wurden auf das Vorhandensein der Gene blaCTX-M, blaOXA und blaSHV (Multiplex-RPA-Assay) sowie des blaTEM-Gens (tHDA-Assay) untersucht. Die Sensitivität, Spezifität sowie die positiven und negativen Vorhersagewerte wurden durch Vergleich mit Nukleotidsequenzierungsergebnissen berechnet, die mit der benutzerfreundlichen Statistiksoftware MEDCALC® (https://www.medcalc.org/calc/diagnostic_test.php) erhalten wurden.

Acht Virulenzgene, nämlich traT, ompT, iutA, fimH, hlyA, iha, papC und cvaC, die häufig mit ExPEC assoziiert sind, wurden durch Multiplex-PCR-Methoden charakterisiert. Drei positive Kontrollgene (fimH, hlyA und iutA) wurden synthetisiert und kommerziell in GeneArt-Vektoren (Invitrogen, USA) kloniert. Die rekombinanten Plasmide wurden dann mit Subcloning Efficiency™ DH5α Competent Cell (Invitrogen, USA) in eine DH5α-kompetente Zelle transformiert. Die Primer für diese drei Virulenzgene (hier entworfen) und fünf Primersätze für die Gene traT, ompT, cvaC, iha und papC (zuvor beschrieben) sind in der Ergänzungstabelle S4 aufgeführt. Der erste Pool besteht aus fimH, hlyA und iutA, während der zweite Pool cvaC, iha, traT, ompT und papC umfasst. Eine Gesamtreaktion von 25 µL, bestehend aus 1 × Standard-Taq-Reaktionspuffer und 1,5 U Taq-Polymerase (New England Biolabs, UK), 0,2 µM jedes Primersatzes (vorwärts und rückwärts), 0,2 mM dNTPs, ~ 100 ng DNA-Matrize und Ultra- Es wurde reines Wasser verwendet. Die optimierte PCR-Bedingung für Virulenzgene war: anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 15 Minuten, gefolgt von 29 Zyklen bei 94 °C für 1 Minute, Annealing bei 56 °C für 1 Minute, Verlängerung bei 72 °C für 1 Minute und Nachverlängerung bei 72 °C für 10 Min. Alle Amplikons wurden mittels 2 %iger Agarosegelelektrophorese analysiert.

Die Quadruplex-PCR wurde durchgeführt, indem auf arpA, chuA, yjaA und TspE4.C2 abgezielt wurde (Clermont et al.). Eine zusätzliche PCR wurde wie zuvor beschrieben20 unter Verwendung spezifischer Primer für die Gruppen C, E und kryptische Clades durchgeführt. Zuvor veröffentlichte Primer und die Amplikongröße sind dargestellt (Ergänzungstabelle S5). Die Phylogruppen B1, B2 und F wurden basierend auf Quadruplex-Ergebnissen zugeordnet, während spezifische Primer verwendet wurden, um die Phylogruppen C, E und andere kryptische Kladen von A, D und Klade I20 zu unterscheiden. Eine Gesamtreaktion von 25 µL, bestehend aus 2,5 µL 10 × Puffer, 0,2 mM jedes dNTPs, 1 µL DNA-Matrize (100 ng), 1,5 U Taq-Polymerase (New England Biolabs, UK), 0,2 µM Primer außer der internen Kontrolle (trpBA). = 0,12 µM) und Milli Q-Wasser verwendet. Wir folgten den gleichen PCR-Bedingungen wie von Clermont et al. beschrieben. 201320. PCR-Produkte wurden mittels 2 %iger Agarosegelelektrophorese analysiert.

Die Assoziation von VF-Genen und Phylogruppen wurde zwischen ESBL- und Nicht-ESBL-ExPEC-Isolaten mithilfe des Mann-Whitney-U-Tests verglichen. Die Verteilung der VF-Gene über Phylogruppen hinweg wurde mithilfe des Friedman- und Kruskal-Wallis-Tests getestet. Ein P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Das Studienprotokoll wurde vom Forschungsausschuss des National Cancer Institute genehmigt (Zertifikatsnummer 020/2562).

Die während der aktuellen Studie generierten Datensätze sind im NCBI-Repository der Genbank verfügbar, mit der Zugangsnummer OP999005-OP999011. Diese Datensätze wurden aus den folgenden öffentlich zugänglichen Ressourcen abgeleitet: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999005, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999006, https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999007, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999008, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999009 , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999010, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP999011.

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Referenzen herunterladen

Wir danken dem Second Century Fund (C2F), Postdoctoral Fellowship, Chulalongkorn University, Bangkok, 10330, Thailand.

Dieses Forschungsprojekt wurde teilweise von der Forschungseinheit für innovative Diagnose antimikrobieller Resistenzen, dem Ratchadapisek Sompoch Endowment Fund und dem Second Century Fund (C2F) der Chulalongkorn University unterstützt. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Forschungseinheit für innovative Diagnose antimikrobieller Resistenzen, Abteilung für Transfusionsmedizin und klinische Mikrobiologie, Fakultät für alliierte Gesundheitswissenschaften, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, Thailand

Naeem Ullah & Nuntaree Chaichanawongsaroj

Programm für Molekularwissenschaften in medizinischer Mikrobiologie und Immunologie, Abteilung für Transfusionsmedizin und klinische Mikrobiologie, Fakultät für alliierte Gesundheitswissenschaften, Chulalongkorn-Universität, Bangkok, Thailand

Thadchaporn Assawakongkarat

Abteilung für Bakteriologie I, Nationales Institut für Infektionskrankheiten (NIID), Tokio, Japan

Yukihiro Akeda

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Diese Studie wurde von NC konzipiert und gestaltet. Die experimentellen Arbeiten und die Datenanalyse wurden von NU und TA durchgeführt, und der Manuskriptentwurf wurde von N erstellt. Einige Reagenzien wurden von YA unterstützt. Die Beschaffung von Mitteln, die statistische Analyse, die Bearbeitung und die Fertigstellung des Manuskripts wurden von durchgeführt NC Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Nuntaree Chaichanawongsaroj.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ullah, N., Assawakongkarat, T., Akeda, Y. et al. Nachweis von β-Lactamase-produzierenden Escherichia coli-Isolaten mit erweitertem Spektrum durch isotherme Amplifikation und Assoziation ihrer Virulenzgene und Phylogruppen mit einer extraintestinalen Infektion. Sci Rep 13, 12022 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39228-w

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Eingegangen: 3. November 2022

Angenommen: 21. Juli 2023

Veröffentlicht: 25. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39228-w

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